[發(fā)明專利]一種神經(jīng)生長因子的提取方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201811342937.1
• 申請日: 2018-11-09
• 公開（公告）號: CN109762056A
• 公開（公告）日: 2019-05-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張世賢;馬磊;張增偉
• 申請（專利權(quán)）人: 舒泰神（北京）生物制藥股份有限公司
• 主分類號: C07K14/48
• 分類號: C07K14/48;C07K1/18;C07K1/20;C07K1/16
• 代理公司: 北京邦信陽專利商標(biāo)代理有限公司 11012
• 代理人: 呂鵬云

本發(fā)明公開了一種神經(jīng)生長因子的提取方法，包括將含有神經(jīng)生長因子的上清液酸化離心得到酸解上清液，將所述酸解上清液進(jìn)行陽離子交換層析，收集含有神經(jīng)生長因子的目的洗脫峰，得到蛋白液1；將蛋白液1進(jìn)行疏水層析，收集含有神經(jīng)生長因子的目的洗脫峰，得到目標(biāo)蛋白液；其中，該方法不包括陽離子反吸附層析步驟。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的方法步驟簡單，更安全可靠，得到的神經(jīng)生長因子樣品的純度、收率和樣品活性均有提高。本發(fā)明不僅適用于鼠神經(jīng)生長因子的提取，也可適用于人神經(jīng)生長因子的提取，為神經(jīng)生長因子的大規(guī)模分離純化提供了新的途徑。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及神經(jīng)生長因子的提取。

背景技術(shù)

自1953年意大利科學(xué)家Levi-Montalcini發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)生長因子(nerve growthfactor，NGF)以來，科學(xué)界拉開了對神經(jīng)生長因子研究的序幕。神經(jīng)系統(tǒng)疾病是臨床上的常見病，但是缺乏有效的防治手段，神經(jīng)生長因子的發(fā)現(xiàn)，給神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療帶來新的曙光。大量的藥效學(xué)實驗和臨床實驗結(jié)果表明，神經(jīng)生長因子對周圍神經(jīng)損傷、周圍神經(jīng)病、周圍神經(jīng)中毒性疾病、腦外傷、視神經(jīng)損傷等具有潛在的或明顯的療效。

完整的神經(jīng)生長因子由α、β、γ三種亞基通過非共價鍵以α₂β₂γ₂的形式組成，沉降系數(shù)為7，故又稱之為7S NGF。7S NGF包含2個鋅原子，以增加其穩(wěn)定性。兩個α亞基無生物學(xué)活性，兩個γ亞基是一種特異性蛋白酶，在NGF結(jié)構(gòu)成熟過程中發(fā)生作用。β亞基由118氨基酸殘基組成，有三對二硫鍵，兩個β亞基又稱為β-NGF，具有NGF的全部生物學(xué)功能，沉降系數(shù)為2.5，故又稱2.5S NGF。不同來源的NGF(如來源于鼠、人、蛇、牛等的NGF)盡管分子量、等電點等理化性質(zhì)有不同，但是β-NGF的基因編碼的氨基酸序列、鏈內(nèi)二硫鍵都非常相似，其中人和鼠的氨基酸序列同源性達(dá)到89％。

正是由于神經(jīng)生長因子的臨床效果明顯，對NGF的制備方式研究也是在不斷的發(fā)展。純化制備文獻(xiàn)或專利報道較多的是提取鼠神經(jīng)生長因子mNGF(mouse NGF)和人神經(jīng)生長因子hNGF(human NGF)。

從小鼠頜下腺中提取的mNGF為天然的鼠神經(jīng)生長因子。因小鼠頜下腺中鼠神經(jīng)生長因子的含量特別豐富，且動物小鼠來源廣泛穩(wěn)定，故已成為天然鼠神經(jīng)生長因子提取的首選來源。舒泰神公司上市的“蘇肽生”(注射用鼠神經(jīng)生長因子)和武漢海特的“金路捷”、北大之路的“恩經(jīng)復(fù)”和麗珠集團(tuán)的“麗康樂”均為從小鼠頜下腺中提取的鼠神經(jīng)生長因子。發(fā)展至今，mNGF的制備方法得到了深度研究，目前來看從鼠中提取鼠神經(jīng)生長因子主要參考Mobley的方法：該提取方法先用CM羧甲基弱陽離子填料進(jìn)行反吸附層析，然后在低pH條件進(jìn)行酸化，各亞基進(jìn)行分離，然后通過梯度洗脫獲得β-NGF，該純化過程中需要使用到兩步透析過程。透析的方法無法控制熱源，時間長、操作復(fù)雜不適合大規(guī)模生產(chǎn)；為了解決上述問題，2015年舒泰神申請了公開號為CN106279397A、名稱為“一種神經(jīng)生長因子的提取方法”的專利，其中保護(hù)的是一種從小鼠頜下腺中提取mNGF的方法，該方法使用疏水層析能達(dá)到去除兩步透析步驟的目的，同時在保持mNGF純度和收率的情況下，終產(chǎn)品在均一性、活性上有明顯提高。

然而，上述mNGF的制備方法不能直接用于hNGF的制備，因為經(jīng)常會出現(xiàn)收率低、活性受到影響的問題。至今為止針對人神經(jīng)生長因子的制備方法研究還比較少。人神經(jīng)生長因子提取制備來源主要有人類胎盤和重組表達(dá)，已知的制備方法存在步驟復(fù)雜、產(chǎn)率低等問題，導(dǎo)致不利于大規(guī)模制備。

因此，研究一種方法簡單、安全可靠，且能保證所獲得的NGF活性高、收率高、適用范圍廣的神經(jīng)生長因子提取方法迫在眉睫。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種神經(jīng)生長因子的提取方法，所述方法簡單，安全可靠，且能保證所獲得的NGF純度高、活性高、收率高，不僅適用于鼠神經(jīng)生長因子的提取，而且適用于人神經(jīng)生長因子的提取。