[發明專利]一種氟蟲腈特異性結合蛋白及其應用

有效

• 申請號: 201811341754.8
• 申請日: 2018-11-12
• 公開（公告）號: CN109293776B
• 公開（公告）日: 2020-10-16
• 發明（設計）人: 楊春江;趙榮茂;吳迪;袁志波;邰宗洋;宋世燕;郭秀鋒
• 申請（專利權）人: 北京納百生物科技有限公司
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44;C07K14/765;G01N33/68;G01N33/558;G01N33/544
• 代理公司: 北京知呱呱知識產權代理有限公司 11577
• 代理人: 馮建基;孫進華

本發明實施例公開了一種氟蟲腈特異性結合蛋白及其應用，該蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本發明上述蛋白易于制備，且能夠與氟蟲腈特異性結合，具有較高的特異性和靈敏度；此外，能夠用于樣品中氟蟲腈的檢測。

技術領域

本發明涉及氟蟲腈檢測技術領域，具體涉及一種氟蟲腈特異性結合蛋白及其應用。

背景技術

氟蟲腈(Fipronil，又稱非潑羅尼，CAS號為120068-37-3)是一種苯基吡唑類殺蟲劑，殺蟲譜廣，對害蟲以胃毒作用為主，兼有觸殺和一定的內吸作用，其作用機理是通過與昆蟲的γ-氨基丁酸受體結合，阻斷γ-氨基丁酸控制的氯離子通道，阻礙氯化物代謝干擾中樞神經系統，導致昆蟲神經和肌肉興奮過度至死亡。氟蟲腈還可用于殺滅貓、狗身上的跳蚤和虱等寄生蟲。

歐洲食品安全局在2006年推薦的氟蟲腈的每日允許攝入量(ADI)為0.0002mg/kg，中國在《食品安全國家標準——食品中農藥最大殘留限量》(GB 2763-2016)中推薦的ADI也為0.0002mg/kg。中國在2016年11月發布的《食品安全國家標準食品中吡唑醚菌酯等50種農藥最大殘留限量(征求意見稿)》中規定氟蟲腈在家禽肉類中的最大殘留限量為0.01mg/kg，在蛋類中為0.02mg/kg。2017年9月，中國農業部發布第2583號公告，禁止氟蟲腈及相關制劑用于食品動物。

目前氟蟲腈的檢測主要以儀器分析方法為主，基于高效液相色譜或者液相色譜質譜聯用技術對各類樣本中的氟蟲腈定量檢測，其儀器設備昂貴、操作繁瑣復雜、無法應用于現場檢測；免疫學檢測方法又存在抗體制備周期長、篩選難度大、過程復雜、費用高等缺陷。

發明內容

本發明實施例的第一目的在于提供一種氟蟲腈特異性結合蛋白，該蛋白易于制備，且能夠與氟蟲腈特異性結合，具有較高的特異性和靈敏度。

本發明實施例的第二目的在于提供一種氟蟲腈特異性結合蛋白在氟蟲腈檢測試劑盒以及膠體金檢測試紙條中的應用，該應用操作簡單，而且能夠快速準確的檢測樣本中的氟蟲腈；此外，實現了對樣品的現場檢測。

為實現上述目的，本發明實施例提供一種特異性結合氟蟲腈的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

在本發明中對所述蛋白的制備方法不做嚴格限制，例如，可以通過人工合成的方法得到，具體地，通過生物信息學手段篩選得到相對應的基因序列如SEQ ID NO.2所示，并通過上述基因序列表達得到。

本發明實施例另一方面提供一種氟蟲腈檢測試劑盒，該試劑盒包括盒體、設置在盒體內可拆卸的酶標板和試劑，所述酶標板的每個孔包被有所述蛋白；所述試劑包括酶標記的氟蟲腈、氟蟲腈標準溶液、顯色液、終止液、洗滌液和樣本稀釋液。

優選地，所述酶標板由包括如下步驟制備得到：

將所述蛋白采用碳酸鹽緩沖液稀釋至0.5-2μg/ml，并向酶標板的每孔中添加50-100μL所述蛋白稀釋液，在3-5℃條件下孵育過夜；隨后，將所述蛋白稀釋液甩干，并以磷酸鹽吐溫緩沖液洗板2-4次，再將封閉液添加到酶標板中，在35-39℃條件下孵育1.5-2.5h，再將封閉液甩干即得所述酶標板；

其中，所述碳酸鹽緩沖液的pH值為9.4-10；優選為9.6；所述封閉液為含有0.05％牛血清白蛋白、5％酪蛋白的0.01M pH7.2PBS溶液或含有1％明膠的0.01M pH7.2PBS溶液。

優選地，所述酶標記的氟蟲腈為辣根過氧化物酶標記的氟蟲腈半抗原。更優選地，所述辣根過氧化物酶標記的氟蟲腈半抗原由包括如下步驟制備得到：