[發(fā)明專利]一種檢測肝癌耐藥細胞株的核酸適體及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811340422.8
• 申請日: 2018-11-12
• 公開（公告）號: CN109337909B
• 公開（公告）日: 2020-10-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 葉茂;譚蔚泓;張琳;張慧
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南大學(xué)
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N33/574;G01N33/569
• 代理公司: 長沙市融智專利事務(wù)所(普通合伙) 43114
• 代理人: 袁靖

本發(fā)明公開了一種檢測肝癌耐藥株細胞的核酸適體及其應(yīng)用。同現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：制備的核酸適體能特異性識別肝癌耐藥株細胞并具有較好的親和力、低免疫原性、分子量小、能夠體外化學(xué)合成、可以對核酸適體的不同部位進行修飾和取代。同時，具有序列穩(wěn)定，便于保存，方便標(biāo)記等優(yōu)勢。采用本發(fā)明的核酸適體進行肝癌耐藥株細胞檢測時，操作更為簡單、迅速，并且本發(fā)明核酸適體的合成成本較抗體制備成本低，且周期短，重現(xiàn)性好。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種可用于檢測肝癌耐藥株細胞的核酸適體及其在制備檢測制劑中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

肝細胞癌(HCC)是世界上最常見的原發(fā)性肝腫瘤，是癌癥死亡的第三大原因，其發(fā)病率增加主要與肝硬化丙型肝炎病毒(HCV)相關(guān)的高發(fā)病率有關(guān)。肝癌是惡性程度高、預(yù)后差的疾病，在我國是第二大惡性腫瘤，我國每年約11萬人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人數(shù)的45％。

隨著醫(yī)學(xué)科技的進步，我國原發(fā)性肝癌的治療取得了長足的進步，形成“以手術(shù)為主綜合治療”的治療原則，提高了肝癌的整體療效，延長患者的生存時間，進一步改善患者的生活質(zhì)量。其中化療是重要的治療方法之一，但由于化療的嚴(yán)重副作用以及腫瘤多藥耐藥性(multiple drug resistance,MDR)的存在使肝癌的化療效果受到嚴(yán)重影響。多藥耐藥性(MDR)定義為癌細胞對一種化學(xué)治療藥物產(chǎn)生耐藥性的同時，伴有對其他具有不同結(jié)構(gòu)和作用機制的化學(xué)治療藥物產(chǎn)生交叉的耐藥性。具體而言，一旦癌細胞獲得對結(jié)構(gòu)和功能上無關(guān)的一些藥物的抗性，無論癌細胞是否曾經(jīng)暴露在這些藥物中，那么它們就已經(jīng)具有MDR表型。一旦癌細胞表現(xiàn)出多藥耐藥性，那么化療藥對癌細胞的抗癌作用就會降低。

發(fā)展識別多藥耐藥性肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中關(guān)鍵蛋白的分子探針將有助于我們從分子水平上了解腫瘤多藥耐藥的機制，為實現(xiàn)多藥耐藥性肝癌的診斷和靶向治療提供新的分子工具。利用核酸適體特異的靶向性，將治療性藥物遞送至癌細胞甚至逆轉(zhuǎn)腫瘤的多藥耐藥性，已經(jīng)成為提高化療療效并減少或消除藥物毒性的有前景的方法。

核酸適體(Aptamer)是短的、有著獨特三維結(jié)構(gòu)的單鏈寡核苷酸，其具有優(yōu)于常規(guī)抗體的幾個優(yōu)勢，例如制備簡單、成本低、靶標(biāo)廣泛(從小分子、肽、蛋白質(zhì)、到整個細胞都能進行高親和力、高特異性識別與結(jié)合)、組織穿透能力強、分子量小、免疫原性低、毒性低以及易修飾等。靶向癌癥相關(guān)受體的核酸適體可以選擇性地將治療性物質(zhì)(抗癌藥物、siRNA、miRNA和藥物載體)遞送至腫瘤內(nèi)區(qū)室，進行腫瘤的殺傷。核酸適體通常是通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù)(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)在體外篩選所得。SELEX技術(shù)的基本步驟有：(1)文庫的制備,一般是合成10¹²～10¹⁵數(shù)量的隨機單鏈庫；(2)與靶物質(zhì)孵育，洗脫不結(jié)合的鏈，把與靶物質(zhì)結(jié)合的鏈進行反篩，洗掉非特異性結(jié)合的鏈，如此反復(fù)篩選，直到篩選到親和力最高特異性最強的寡核苷酸鏈；(3)收集與靶物質(zhì)結(jié)合的鏈進行PCR擴增，然后純化。

Cell-SELEX是指以活細胞為靶標(biāo)，進行適配體的篩選的一種SELEX技術(shù)。cell-SELEX技術(shù)提供了鑒定針對已知生物標(biāo)志物的適配體和細胞膜表面上的新生物標(biāo)志物的機會。在cell-SELEX中，靶分子具有其自身的天然構(gòu)象，這使得用于治療和診斷應(yīng)用的適配體開發(fā)更容易。它還減輕了處理靶分子構(gòu)象的復(fù)雜性，并增加了找到有效適配體的可能性。另外，由于靶分子在cell-SELEX中錨定于細胞表面，因此不需要純化靶標(biāo)或?qū)蟹肿庸潭ㄔ诠腆w支持物上。由于這些優(yōu)勢，cell-SELEX已廣泛用于獲得針對癌癥細胞、腫瘤相關(guān)蛋白、寄生蟲、病毒感染細胞和全細胞等靶標(biāo)的高度特異性適配體。