[發明專利]煙草AKT1基因及應用

有效

• 申請號: 201811339660.7
• 申請日: 2018-11-12
• 公開（公告）號: CN109371037B
• 公開（公告）日: 2021-08-31
• 發明（設計）人: 任學良;王仁剛;李立芹;魯黎明;王自力;張潔
• 申請（專利權）人: 貴州省煙草科學研究院
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C07K14/415;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/82;A01H6/20
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;黃爽

本發明涉及煙草AKT1基因及應用。所述煙草AKT1基因及其編碼蛋白質的序列分別如SEQ ID NO:1和2所示。本發明首次從煙草中克隆得到AKT1基因并通過酵母功能互補實驗驗證了該基因的生物學功能，煙草AKT1基因具有促進鉀離子吸收和轉運的功能。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體地說，涉及煙草AKT1基因及應用。

背景技術

鉀離子通道是允許鉀離子特異通透質膜的離子通道，而阻礙其他離子通透，特別是鈉離子。這些通道一般由兩部分組成：一部分是通道區，選擇并允許鉀離子通過，而阻礙鈉離子；另一部分是門控開關，根據環境中的信號而開關通道。

現有技術對于鉀離子通道基因的研究在模式植物擬南芥中比較廣泛，例如，研究表明擬南芥鉀通道基因AKT1編碼一個內向整流通道，可以形成同源多聚體，主要在擬南芥根的表皮和皮層細胞中表達(Basset et al.,1995；Lagarde et al.,1996)；AKT1負責介導擬南芥根細胞從土壤中吸收鉀營養，AKT1的功能缺失造成AKT1突變體植株K⁺吸收能力降低，從而使得AKT1突變體冠部的K⁺含量顯著降低，導致幼苗在低鉀脅迫下表現出冠部失綠黃化的低鉀敏感表型(Lagarde et al.,1996；Hirsch et al.,1998；Spalding et al.,1999；Xu et al.,2006)。

煙草是一種耗鉀量很大的作物，煙葉鉀含量是衡量煙葉品質的的重要指標，目前，對于煙草中鉀離子通道的研究較少。

發明內容

本發明的目的是提供煙草AKT1基因及其編碼的蛋白質。

本發明的另一目的是提供煙草AKT1基因的應用。

為了實現本發明目的，本發明提供的煙草AKT1基因，其為編碼如下蛋白質(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；

(b)SEQ ID NO:2所示序列經取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白質。

本發明煙草AKT1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，基因全長2391bp。本發明采用如下方法克隆得到煙草AKT1基因：

①在進行AKT1基因PCR擴增之前，提取煙草細胞總RNA，并將提取得到的總RNA反轉錄為cDNA。在本發明中，所述的煙草細胞總RNA的提取采用本領域常用的提取細胞總RNA的技術方案即可，本發明的實施例中具體的可采用Trizol法。在本發明中，所述的煙草細胞總RNA提取的原料為煙草的新鮮葉片，所述煙草采用為本領域常規的煙草品種，如K326。

②在提取得到煙草細胞總RNA后，將所述煙草細胞總RNA反轉錄合成cDNA。在本發明中，所述的cDNA的合成采用本領域常規的cDNA的合成方法即可，無其他特殊要求；具體的本發明實施例中采用TaKaRa公司的cDNA合成試劑盒完成cDNA的合成。

③在得到cDNA之后，進行AKT1基因PCR擴增，得到目的片段。在本發明中，所述AKT1基因PCR擴增的體系優選為20μL體系，包括Premix ExTaq 10μL，10μM的正向引物0.5μL，10μM的反向引物0.5μL，煙草細胞cDNA 1μL，ddH₂O 8μL。在本發明中，所述AKT1基因的PCR擴增的反應程序優選為：95℃預變性5min；95℃變性30s；55℃退火30s；72℃延伸2min；35個循環。

④在AKT1基因PCR擴增得到目的片段后，將所述目的片段進行測序，得到AKT1基因。本發明在所述的PCR擴增后優選的對目的片段進行純化，本發明對所述純化的方法沒有特殊的限定，采用本領域技術人員熟知的DNA純化試劑盒進行即可。