[發明專利]一種丹參酮IIA誘導癌細胞HepG2凋亡的實驗方法

在審

• 申請號: 201811339315.3
• 申請日: 2018-11-12
• 公開（公告）號: CN109432104A
• 公開（公告）日: 2019-03-08
• 發明（設計）人: 潘紅蓮
• 申請（專利權）人: 潘紅蓮
• 主分類號: A61K31/58
• 分類號: A61K31/58;A61P35/00;G16B50/00;G16B40/00;G16B45/00;G16B20/30;G16B35/20;C12N5/09;C12Q1/686;G01N33/68;G01N15/14
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• 代理人: 暫無信息

1.一種丹參酮IIA誘導癌細胞HepG2凋亡的實驗方法，其特征在于，具體的實驗過程如下：

（1）實驗材料準備：丹參酮IIA（> 98.0％）；p53，Bcl2和SHP2抗體；通過primer 5.0設計了Tp53，PTPN11，miR30a，b，c和d，Bax，Bcl2和p21的mRNA序列；Annexin V-FITC染色試劑盒和3-（4，5-二甲基-2-噻唑基）-2，5-二苯基四唑溴化物（MTT）溶液；細胞培養基DMEM和胎牛血清（FBS）；

（2）細胞培養與處理：人肝癌細胞為HepG2和Hep3B，將細胞用含有10％胎牛血清、青霉素100U/mL、鏈霉素100μg/mL的DMEM培養液于37℃，5％CO2條件下培養，當匯合時，用一系列劑量的丹參酮IIA處理細胞，24小時后，收集培養基和細胞，并制備用于以下生物測定；

（3）RT-PCR測定：根據試劑盒說明從細胞中提取總RNA，通過Nano Drop測定RNA的質量，相應基因的擴增通過Applied Biosystems進行，通過2-△△CT計算數據，并與空白樣品相比分析每個基因的誘導倍數；

（4）Western Blot測定：用具有1mM苯甲基磺酰氟（PMSF）的RIPA裂解物分離總細胞蛋白，蛋白質濃度按照BCA試劑盒說明書的指導進行測定，在SDS-10％聚丙烯酰胺凝膠上分離約50μg蛋白質，然后轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，在5％脫脂奶粉中封閉后，將膜與抗體在4℃下孵育過夜，第二天，將膜與第二抗體雜交，通過使用化學發光試劑觀察蛋白質，并在ChemiScope上觀察，并使用軟件ChemiAnalysis來計算蛋白質條帶的密度；

（5）Annexin V-FITC染色：收集細胞并用5μL Annexin V-FITC和10μL PI染色，在黑暗中孵育至少5分鐘后，通過流式細胞術分析凋亡細胞；

（6）生物信息數據庫篩選與分析：我們對59篇文獻中所涉及到的部分基因進行了一下整理，過濾掉人意外物種的基因，修正基因symbol，過濾重復基因，最終得到61個基因，GeneCodis是一個整合了各種分析工具和數據的生物信息數據庫，為大規模的基因或蛋白列表提供系統綜合的生物功能注釋信息，在此，我們使用GeneCodis對這61個基因集執行Go富集分析和信號通路功能注釋，GeneMania數據庫通過嵌入軟件cytoscape能對61列表基因進行相關關系網絡圖譜繪制，61個選擇的基因的網絡由GeneMania自動產生并通過Cytoscape顯現，Gene2Networks整合了十個哺乳動物相互作用網絡數據集，相關圖像的重建由Gene2Networks與Cytoscape進行，為了進一步確定丹參酮IIA影響的途徑，我們在Cytoscape中繪制了相互作用網絡圖以便找出感興趣的信號分子；

（7）轉錄因子篩選測定：LASAGNA-Search 2.0提供1792個轉錄因子模型和15個啟動子檢索物種是TF結合位點研究的網絡工具，可在http://biogrid-head.engr.uconn.edu/lasagna_search/ [LASAGNA-Search2.0： 綜合轉錄因子結合位點搜索和在瀏覽器中的可視化]，在本研究中，我們使用LASAGNA-Search 2.0篩選靶向基因的TF，在輸入基因符號并選擇物種作為人后，我們獲得了TF的名稱，我們的基因組的結合序列，結合位置，鏈，結合分數，p值和E值，在P<0.01時具有最大結合評分的序列被認為是靶向基因的結合位點；

（8）Hoechst 33324染色：細胞中染色質的凝集是指示細胞毒性的一個毒理學終點，用一定劑量的丹參酮IIA作用24小時后，使用Hoechst-33324染色HepG2細胞，室溫下染20min，并用PBS洗滌兩次，在Leica熒光顯微鏡下觀察細胞的形態；

（9）體外動力學結合分析：p53和PTPN11之間的結合親和力的潛力在生物分子相互作用分析多層陣列HT上進行，將二十八個PTPN11序列，雷帕霉素（設定為陽性對照）和DMSO（陰性對照）印在3D光交聯的小分子微陣列上，每個樣品重復三次，將微陣列真空干燥，并在光交聯劑中進行交聯反應，用去離子水洗滌物理吸收，然后在使用前用N 2流干燥，在25℃下在加樣緩沖液（PBS, pH = 7.4）中加載約650μL的系列濃度的p53（75, 150, 300, 600nM），結合和解離的租用時間為300秒，流速為2μL /秒，微陣列的表面通過Gly-HCl（10mM, pH =2.0）以3μL /秒的再生速率再生300秒，實驗由Plexera SPRi系統實時監測，系統的響應與結合到小分子的蛋白質的質量正相關；

（10）統計分析：利用SPSS17.0統計軟件，計量資料呈正態分布且符合方差齊性，采用單因素方差分析，用均數±標準差（x±SD）表示，以P>0.05表示無統計學意義，P<0.05為差異有統計學意義，P<0.01表示有非常顯著性統計學意義。

2.根據權利要求1所述的一種丹參酮IIA誘導癌細胞HepG2凋亡的實驗方法，其特征在于，所述的本實驗通過miR30b-p53-PTPN11 / SHP2信號通路誘導來實現人肝癌細胞HepG2凋亡。