[發明專利]一種尿苷二磷酸葡萄糖及尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的生物合成方法

有效

• 申請號: 201811338833.3
• 申請日: 2018-11-12
• 公開（公告）號: CN109371079B
• 公開（公告）日: 2019-09-06
• 發明（設計）人: 生舉正;徐以泓;孟丹華
• 申請（專利權）人: 安徽禾庚生物技術有限公司
• 主分類號: C12P19/30
• 分類號: C12P19/30;C12R1/19
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 陳桂玲

1.一種尿苷二磷酸葡萄糖的生物合成方法，其特征在于，步驟如下：

(1)在反應液中，以可溶性淀粉和磷酸鹽為底物，以含有誘導表達好高溫α-葡聚糖磷酸化酶的重組大腸桿菌為催化劑，生物合成得到1-磷酸-葡萄糖；

(2)取步驟(1)得到的1-磷酸-葡萄糖，加入鎂離子、磷酸二氫鈉緩沖液、尿苷三磷酸，以含有誘導表達好高溫糖-1-磷酸核苷酸化酶的重組大腸桿菌為催化劑，生物合成得到尿苷二磷酸葡萄糖。

2.如權利要求1所述的生物合成方法，其特征在于，步驟(1)中包括以下條件：

i.所述可溶性淀粉在反應液中的終濃度為45～55g/L；

ii.所述磷酸鹽為KH₂PO₄和K₂HPO₄；

iii.所述含有誘導表達好高溫α-葡聚糖磷酸化酶的重組大腸桿菌加量為6～7g菌體干重/L反應液；

iv.所述生物合成的反應溫度為70℃，反應時間大于180min。

3.如權利要求2所述的生物合成方法，其特征在于，所述磷酸鹽是將KH₂PO₄和K₂HPO₄溶解于水中配制成KP溶液，所述KP溶液中PO₄^3-的總濃度為1M，pH為6～7，所述KP溶液中PO₄^3-在反應液中的終濃度為0.2～0.9M。

4.如權利要求1所述的生物合成方法，其特征在于，步驟(2)中包括以下條件：

i.所述1-磷酸-葡萄糖在反應體系中終濃度為0.4～0.6g/L；

ii.所述磷酸二氫鈉緩沖液的組分為NaH₂PO₄ 0.2M，NaOH調節pH6～11；

iii.所述尿苷三磷酸的終濃度為0.05～3.0mM；

iv.所述含有誘導表達好高溫糖-1-磷酸核苷酸化酶的重組大腸桿菌的加量為3.0～5.5g菌體干重/L反應液；

v.所述生物合成的反應溫度為70～90℃，反應時間大于60min。

5.如權利要求4所述的生物合成方法，其特征在于，所述鎂離子由氯化鎂水解產生，鎂離子的終濃度為10～20mM。

6.如權利要求1所述的生物合成方法，其特征在于，所述誘導表達的步驟包括：

將含有目的基因TmαGP的重組大腸桿菌或含有目的基因StUSP的重組大腸桿菌接種于30mL含100μg/mL氨芐青霉素的LB培養基中，37℃225rpm活化12～14h；將活化后的重組大腸桿菌接種于250mL含100μg/mL氨芐青霉素的LB培養基中進行擴大培養，初始OD₆₀₀值為0.05；37℃225rpm培養至OD₆₀₀值為0.6～0.8時，加入終濃度為0.2mM的IPTG誘導，誘導條件為22℃225rpm，18～20h，測量重組大腸桿菌菌液的OD₆₀₀值，即得含有誘導表達好高溫α-葡聚糖磷酸化酶的重組大腸桿菌或含有誘導表達好高溫糖-1-磷酸核苷酸化酶的重組大腸桿菌；

其中，所述含有目的基因TmαGP的重組大腸桿菌所用質粒載體為pET20b，所用菌株為E.coliBL21(DE3)；所述含有目的基因StUSP的重組大腸桿菌所用質粒載體為pET21b，所用菌株為E.coliBL21(DE3)。

7.如權利要求6所述的生物合成方法，其特征在于，所述含有目的基因TmαGP的重組大腸桿菌誘導表達后的OD₆₀₀值為2.1～2.3；所述含有目的基因StUSP的重組大腸桿菌誘導表達后的OD₆₀₀值為2.4～2.6。