[發(fā)明專(zhuān)利]一種提高玻璃化冷凍成熟卵母細(xì)胞孤雌發(fā)育潛力的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811334805.4
• 申請(qǐng)日: 2018-11-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109294978A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周光斌;潘波;張?jiān)?/a>;李偉;楊昊軒
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/073
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/073
• 代理公司: 北京眾合誠(chéng)成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 苗艷榮

1.一種提高玻璃化冷凍成熟卵母細(xì)胞孤雌發(fā)育潛力的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)卵母細(xì)胞收集：采集7-8周齡雌性小鼠輸卵管，脫去顆粒細(xì)胞，洗滌后待用；

2)卵母細(xì)胞玻璃化冷凍：卵母細(xì)胞在預(yù)處理液中處理30秒，然后轉(zhuǎn)移至冷凍液中處理25秒，迅速將裝載有卵母細(xì)胞的開(kāi)放式拉長(zhǎng)塑料細(xì)管(Open Pulled Straw,OPS)投入到液氮；

3)卵母細(xì)胞解凍：OPS管從液氮中取出，立即浸入37.5℃恒溫的蔗糖溶液中，然后將卵母細(xì)胞吹出至蔗糖溶液大液滴中，洗滌后轉(zhuǎn)移至蔗糖溶液小液滴中，此過(guò)程共計(jì)5分鐘。然后轉(zhuǎn)移至預(yù)先在培養(yǎng)箱中孵育約8小時(shí)的M₂中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時(shí)；

4)卵母細(xì)胞孤雌激活：體外培養(yǎng)1小時(shí)后，成熟卵母細(xì)胞在孤雌激活A(yù)液中洗滌3次，后轉(zhuǎn)入另一A液中，并在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2.5小時(shí)，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)至孤雌激活B液中，洗滌3次后置入另一B液中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3.5小時(shí)；

5)孤雌激活胚胎體外培養(yǎng)：將孤雌激活后的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高玻璃化冷凍成熟卵母細(xì)胞孤雌發(fā)育潛力的方法，其特征在于，步驟(1)中所述的預(yù)處理液為10％EG(ethylene glycol)+10％DMSO(Dimethylsulfoxide)，其中含有褪黑素，其濃度為10^-9mol/L；所述的冷凍液選自含褪黑素濃度為10^-9mol/L的EDFS30(EG和DMSO以DPBS為溶劑稀釋成10％(v/v)EG+10％(v/v)DMSO；含有30％(w/v)Ficoll和0.5mol/L蔗糖的冷凍液稱(chēng)為FS液，EG、DMSO和FS液按體積比為1.5:1.5:7混合后即得EDFS30)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高玻璃化冷凍成熟卵母細(xì)胞孤雌發(fā)育潛力的方法，其特征在于，步驟(2)中蔗糖溶液的濃度為0.5mol/L，所述的蔗糖溶液和M₂液中均含有10^-9mol/L的褪黑素。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高玻璃化冷凍成熟卵母細(xì)胞孤雌發(fā)育潛力的方法，其特征在于，步驟(2)中培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件為：5％CO₂，37.5℃，100％濕度。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高玻璃化冷凍成熟卵母細(xì)胞孤雌發(fā)育潛力的方法，其特征在于，步驟(4)中孤雌激活A(yù)液為：890μL HTF+100μL SrCl₂+10μL細(xì)胞松弛素D(Cytochalasin D,CD)，且含10^-9mol/L的褪黑素；孤雌激活B液為：990μL HTF+10μL CD，且含10^-9mol/L褪黑素。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高玻璃化冷凍成熟卵母細(xì)胞孤雌發(fā)育潛力的方法，其特征在于，步驟(5)中胚胎培養(yǎng)液為添加10^-9mol/L褪黑素的KSOM。