[發(fā)明專利]凡納濱對蝦熱休克蛋白40基因lvHSP40及其在抑制對蝦卵巢發(fā)育中的應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2018-11-09
• 公開（公告）號: CN109468327B
• 公開（公告）日: 2021-01-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳廷;任春華;黃文;江曉;羅鵬;胡超群
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院南海海洋研究所
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/113;C07K14/435;A61K31/713;A61P15/00
• 代理公司: 廣州科粵專利商標(biāo)代理有限公司 44001
• 代理人: 胡素麗;劉明星

本發(fā)明公開了一種凡納濱對蝦熱休克蛋白40基因lvHSP40及其在抑制對蝦卵巢發(fā)育中的應(yīng)用。本發(fā)明的凡納濱對蝦熱休克蛋白40基因lvHSP40，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1中的第174位至1364位堿基所示。本發(fā)明首次從凡納濱對蝦中克隆出凡納濱對蝦熱休克蛋白40基因lvHSP40，并通過實(shí)驗(yàn)證明注射針對該基因設(shè)計(jì)的siRNA可以有效抑制凡納濱對蝦雌蝦的卵巢發(fā)育。本發(fā)明針對缺少有效抑制凡納濱對蝦卵巢發(fā)育的方法的問題，提供了一種有效的技術(shù)手段，具有廣泛的應(yīng)用前景和極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及凡納濱對蝦熱休克蛋白40基因lvHSP40及其在抑制對蝦卵巢發(fā)育中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)俗稱南美白對蝦，原產(chǎn)自太平洋東海岸，由于其生長速度快、抗病抗逆能力強(qiáng)、對飼料要求低、肉質(zhì)鮮美、出肉率高和離水存活時(shí)間長等優(yōu)點(diǎn)，是世界公認(rèn)的養(yǎng)殖對蝦優(yōu)良品種。自1988年從美國夏威夷引進(jìn)后，凡納濱對蝦已發(fā)展成我國最重要的對蝦養(yǎng)殖品種，其養(yǎng)殖產(chǎn)量超過全國對蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量的70％。然而在人工養(yǎng)殖條件下，凡納濱對蝦的親本雌蝦和雄蝦性腺難以同步發(fā)育，在生產(chǎn)中影響交配和繁育效率。目前生產(chǎn)上采用單側(cè)眼柄摘除方法促進(jìn)雌蝦卵巢發(fā)育，而缺少有效抑制卵巢發(fā)育的方法。

40道爾頓熱休克蛋白又稱為熱休克蛋白40(HSP40)，是一個廣泛存在于從細(xì)菌到人類各種生物中的分子伴侶蛋白，其特征在于蛋白的N端存在一個序列上類似大腸桿菌DnaJ蛋白的結(jié)構(gòu)區(qū)。作為一個分子伴侶蛋白，HSP40會對熱激、活性氮/活性氧釋放和缺氧等壓力作出反應(yīng)，進(jìn)行表達(dá)和合成。在功能上，HSP40參與到細(xì)胞中的ATP分解、DNA結(jié)合、蛋白分解、胞內(nèi)信號傳遞、外泌、內(nèi)吞、病毒感染、凋亡等過程中。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種凡納濱對蝦熱休克蛋白40基因lvHSP40及其在抑制對蝦卵巢發(fā)育中的應(yīng)用。

本發(fā)明通過構(gòu)建凡納濱對蝦肝胰腺轉(zhuǎn)錄組，從中發(fā)現(xiàn)一個通過比對方法注釋為HSP40的1075堿基組裝片段，以此設(shè)計(jì)基因特異引物，通過3’、5’-RACE方法擴(kuò)增獲得凡納濱對蝦熱休克蛋白40基因lvHSP40的cDNA全長序列。獲得的lvHSP40cDNA序列全長1756堿基，其序列如SEQ ID NO.1所示。lvHSP40cDNA包含一個1191堿基開放閱讀框(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1中的第174位至1364位堿基所示)，其編碼蛋白具有396個氨基酸，其序列如SEQID NO.2所示。將lvHSP40基因cDNA及編碼蛋白序列在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中采用Blastx程序進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)lvHSP40基因cDNA及編碼蛋白序列不與任何先前已公布的蛋白序列完全一致，說明其是新發(fā)現(xiàn)的核苷酸與蛋白序列。

因此，本發(fā)明的第一個目的是提供一種凡納濱對蝦熱休克蛋白40基因lvHSP40，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1中的第174位至1364位堿基所示。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種由所述的凡納濱對蝦熱休克蛋白40基因lvHSP40編碼的凡納濱對蝦熱休克蛋白40，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。考慮到密碼子的簡并性，在不改變氨基酸序列的前提下，對上述編碼基因的核苷酸序列進(jìn)行修改，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

本發(fā)明根據(jù)凡納濱對蝦熱休克蛋白40基因lvHSP40的cDNA序列設(shè)計(jì)siRNA HSP40-474(正義鏈為：5’-GCAGGUCCGGAUUCAACAATT-3’，反義鏈為：5’-UUGUUGAAUCCGGA CCUGCTT-3’)，注射到卵巢發(fā)育期的凡納濱對蝦雌蝦，能有效敲降lvHSP40mRNA表達(dá)水平，并能有效抑制雌蝦卵巢發(fā)育。其抑制卵巢發(fā)育特征包括：1)siRNA HSP40-474注射組對蝦的性腺指數(shù)(GSI)低于對照組；2)siRNA HSP40-474注射組對蝦的性腺組織學(xué)切片分期落后于對照組；3)siRNA HSP40-474注射組對蝦的排卵時(shí)間晚于對照組。