[發(fā)明專利]一種表達制備乳二糖磷酸化酶的方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201811331201.4 | 申請日： | 2018-11-09 |
| 公開（公告）號： | CN109234299B | 公開（公告）日： | 2021-08-13 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 李拖平;李蘇紅;佟超男;孫玥 | 申請（專利權(quán)）人： | 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) |
| 主分類號： | C12N15/75 | 分類號： | C12N15/75;C12N1/21;C12N9/10;C12R1/125 |
| 代理公司： | 沈陽杰克知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 21207 | 代理人： | 胡洋 |
| 地址： | 110000 遼寧省沈*** | 國省代碼： | 遼寧;21 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 表達 制備 乳二糖 磷酸化酶 方法 | ||
本發(fā)明涉及一種高效表達制備乳二糖磷酸化酶的方法，是將乳二糖磷酸化酶LNBP基因與枯草芽孢桿菌用載體構(gòu)建重組表達載體。然后將重組表達載體轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌中構(gòu)建重組工程菌。將重組工程菌在液體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，菌液離心，取上清液。本發(fā)明的方法乳二糖磷酸化酶產(chǎn)量高，蛋白較純凈，回收純化容易，生產(chǎn)操作簡單，為LNBP的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)提供了便利，提高了產(chǎn)量，省時省力，節(jié)約成本。尤其是對該酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供了安全保障，具有重大意義。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種能高效表達乳二糖磷酸化酶的重組工程菌以及用改進高效表達制備乳二糖磷酸化酶的方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)
LNBP(EC2.4.1.211,lacto-N-biose phosphorylase,LNBP)是一種可逆的磷酸化酶，可以催化LNB和GNB(galacto-N-biose)產(chǎn)生N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)和β-D-半乳糖1-磷酸(Gal 1-P)。證實雙歧桿菌中具有編碼代謝LNB的基因簇，其中LNB通過特定的ABC型轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)，通過LNBP并最終在糖酵解和氨基糖代謝途徑中被代謝。雙歧桿菌是嬰幼兒腸道中重要的優(yōu)勢菌，也是人體腸道內(nèi)最主要的有益菌之一，對維持嬰幼兒健康發(fā)育有著極其重要的作用。乳二糖(lacto-N-biose，LNB)是母乳中寡糖的重要組成部分，也是雙歧桿菌維持生命活動的重要底物，對促進雙歧桿菌在嬰幼兒腸道中的定植與增殖具有重要的作用。雙歧桿菌可以通過乳二糖磷酸化酶來代謝LNB獲得生命活性所需要的能量。此外，枯草芽孢桿菌被認為是動物腸道內(nèi)的益生菌，安全性高，可應(yīng)用于食品、藥品等工業(yè)中，具有非致病性；外源DNA獲取方便，不僅質(zhì)粒可作為異源基因的克隆載體，噬菌體也可以應(yīng)用于此，具有較強的遺傳特性；蛋白的分泌系統(tǒng)較為完善，分泌的外源蛋白可跨過細胞膜直接釋放到細胞外，具有較強的蛋白分泌能力，從而簡化蛋白的回收和純化過程，適用于工業(yè)化生產(chǎn)；在較為簡單的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，就能達到很高的菌密度，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。然而現(xiàn)有技術(shù)中，乳二糖磷酸化酶在野生菌中提取時的產(chǎn)率很低，分離精制困難，不適合大批量的制備。有通過大腸桿菌表達乳二糖磷酸化酶的，但在大腸桿菌中是胞內(nèi)表達，易形成包涵體，同時，酶蛋白的獲取需要對細胞進行破碎處理，雜蛋白含量高，分離精制困難，操作繁瑣耗時，蛋白表達量也不高。
發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的之一是采用基因工程技術(shù)構(gòu)建一種高效表達乳二糖磷酸化酶的重組表達載體及重組工程菌。
本發(fā)明的目的之二是提供一種產(chǎn)量高，蛋白較純凈，回收純化容易，生產(chǎn)操作簡單的利用重組工程菌生產(chǎn)乳二糖磷酸化酶的方法。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種高效表達乳二糖磷酸化酶的重組表達載體，所述的重組表達載體是將乳二糖磷酸化酶(LNBP)基因與表達載體連接，構(gòu)建的重組表達載體；所述的表達載體是枯草芽孢桿菌用載體或大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體。
進一步的，上述的高效表達乳二糖磷酸化酶的重組表達載體，所述的表達載體是pHT系列載體、穿梭載體pMA5或穿梭載體pWB980等。但不限于這些載體，所有枯草芽孢桿菌用載體或大腸桿菌-枯草芽孢桿菌用穿梭載體均可使用。
更進一步的，上述的高效表達乳二糖磷酸化酶的重組表達載體，所述的pHT系列載體是pHT43、pHT304或pHT01載體。
進一步的，上述的高效表達乳二糖磷酸化酶的重組表達載體，所述的表達載體中含有或不含有蛋白純化標(biāo)簽。
更進一步的，上述的高效表達乳二糖磷酸化酶的重組表達載體，所述的蛋白純化標(biāo)簽是組氨酸(His-tag)標(biāo)簽。
一種高效表達乳二糖磷酸化酶的重組工程菌，是將上述的高效表達乳二糖磷酸化酶的重組表達載體轉(zhuǎn)化至宿主菌中構(gòu)建的重組工程菌；所述的宿主菌是枯草芽孢桿菌。
進一步的，上述的一種高效表達乳二糖磷酸化酶的重組工程菌，所述的轉(zhuǎn)化為電轉(zhuǎn)化。
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