[發明專利]人類四個泛素基因mRNA表達水平熒光定量PCR的檢測方法

在審

• 申請號: 201811330190.8
• 申請日: 2018-11-09
• 公開（公告）號: CN109439736A
• 公開（公告）日: 2019-03-08
• 發明（設計）人: 陳琦;楊麗婷;雷薇;萬亮華;吳決連;范麗;楊媚;廖琳玉;覃萍;馬珊珊
• 申請（專利權）人: 南寧國拓生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/6883;C12N15/11
• 代理公司: 桂林市持衡專利商標事務所有限公司 45107
• 代理人: 湯凌志

1.人類四個泛素基因mRNA表達水平熒光定量PCR的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)引物設計：設計人基因組中四個泛素基因UBB、UBC、UBA52、RPS27A的mRNA表達量的引物以及作為內參基因的GAPDH基因特異性引物；

2)細胞總RNA的提取純化：從培養細胞中提取總RNA，并消化DNA；

3)反轉錄合成cDNA第一鏈：取1ug總RNA作為模板，反轉錄合成cDNA第一鏈；

4)熒光定量PCR反應：使用SYBR Green I染料法，分別在每個反應管中加入熒光定量PCR預混合液，相應基因的上游及下游引物，在AnalytikJena qTOWER 2.0熒光定量PCR儀上進行；

5)溶解曲線分析：

所敘步驟5)中溶解曲線的反應條件：擴增溫度以0.5℃的增幅從60℃緩慢遞增到95℃，升溫的同時連續測定樣品的熒光強度以獲取溶解曲線；

步驟5)溶解曲線分析中，UBB、UBC、UBA52和RPS27A基因均只有一個特異性溶解曲線峰，溶解溫度分別為82.67℃、85.35℃、86.93℃和80.25℃，說明所設計的引物具有較好的特異性，可以用于基因表達量分析；

步驟5)溶解曲線分析中，GAPDH基因只有一個特異性溶解曲線峰，溶解溫度為85.2℃，說明所設計的引物具有較好的特異性，可以用于基因表達量分析；

步驟1)所述的人基因組中四個泛素基因UBB、UBC、UBA52、RPS27A的mRNA表達量的引物，是一套用于檢測人基因組中四個泛素基因UBB、UBC、UBA52、RPS27A的表達量的引物，保證四個泛素基因的引物都是特異檢測該基因的mRNA表達量，不受泛素序列高度保守的影響：

UBB基因特異性上游引物的序列：

UBB F：5’-CTGAGGGGTGGCTGTTAATT-3’，

UBB基因特異性下游引物的序列：

UBB R：5’-CATTTTGAACAGGTTCAGCT-3’；

UBC基因特異性上游引物的序列：

UBC F：5’-AAGGCATCCCTCCTGATCAG-3’，

UBC基因特異性下游引物的序列：

UBC R：5’-AGGGGAAACTTAGACACCCC-3’；

UBA52基因特異性上游引物的序列：

UBA52 F：5’-AGGAGGGTATCCCACCTGAC-3’，

UBA52基因特異性下游引物的序列：

UBA52 R：5’-CAATAATGCCACCTCGCAGG-3’；

RPS27A基因特異性上游引物的序列：

RPS27A F：5’-GGAAGATGGACGTACTTTGT-3’，

RPS27A基因特異性下游引物的序列：

RPS27A R：5’-TTCTTGGGAGTGGTGTAAGA-3’；

步驟1)所述的作為內參基因的GAPDH基因特異性引物，是一對用于校正樣品之間的上樣量差異、個體差異的內參引物，

內參基因GAPDH基因特異性上游引物的序列：

GAPDH F：5’-CCTGCACCACCAACTGCTTA-3’，

內參基因GAPDH基因特異性下游引物的序列：

GAPDH R：5’-GGCCATCCACAGTCTTCTGAG-3’。