[發(fā)明專利]一種驗(yàn)證ELISA法和HPLC法之間存在相關(guān)性和線性關(guān)系的方法

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• 申請日: 2018-11-09
• 公開（公告）號: CN109357927A
• 公開（公告）日: 2019-02-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 葉璟;陳佳文;王春暉;黃晨;聶犇
• 申請（專利權(quán)）人: 上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)
• 主分類號: G01N1/34
• 分類號: G01N1/34;G01N33/53;G01N30/02
• 代理公司: 上海精晟知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31253
• 代理人: 楊軍

1.一種驗(yàn)證ELISA法和HPLC法之間存在相關(guān)性和線性關(guān)系的方法，其特征在于，包括以下步驟：利用ELISA法和HPLC法分別對待測樣品進(jìn)行檢測，將兩種方法檢測得到的最終數(shù)據(jù)進(jìn)行雙樣本均值分析，通過返回相關(guān)性檢驗(yàn)值來判斷兩種方法之間是否存在相關(guān)性；再通過對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行線性比對及線性擬合，得到方程，通過其相關(guān)系數(shù)和斜率來判斷兩種方法是否具有線性關(guān)系。

2.如權(quán)利要求1所述的驗(yàn)證ELISA法和HPLC法之間存在相關(guān)性和線性關(guān)系的方法，其特征在于：所述ELISA法和HPLC法均采用外標(biāo)法檢測數(shù)據(jù)。

3.如權(quán)利要求1所述的驗(yàn)證ELISA法和HPLC法之間存在相關(guān)性和線性關(guān)系的方法，其特征在于，包括以下步驟，

1)培養(yǎng)待測藍(lán)藻藻液樣品的步驟：

準(zhǔn)備好相對應(yīng)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為高壓滅菌的BG-11，取5-10mL藻液加入到配制好的BG11滅菌培養(yǎng)液中，控制其初始吸光度，使其一致，培養(yǎng)幾天后，若微囊藻的生長狀況較好，藻菌數(shù)量在肉眼觀察下增多，微囊藻的外觀顏色較好，則對微囊藻按藻液:培養(yǎng)基為1:5的接種比例再次進(jìn)行轉(zhuǎn)接培養(yǎng)；然后將培養(yǎng)7天后的銅綠微囊藻原樣按照1:5的接種比例轉(zhuǎn)接到6個(gè)250mL的錐形瓶，控制初始吸光度A＝0.1；

2)樣品預(yù)處理的步驟：

ELISA法：取藻液15mL，三組平行，置于細(xì)胞破碎儀中超聲破碎8min，之后于0℃、8000r/min條件下進(jìn)行冷凍離心分離拿出進(jìn)行冷凍離心，然后取清夜為樣品；

HPLC法：取藻液15mL，三組平行，置于細(xì)胞破碎儀中超聲破碎8min，之后于0℃、8000r/min條件下進(jìn)行冷凍離心分離拿出進(jìn)行冷凍離心，取清液，再將萃取柱裝在萃取儀上，將清夜倒入萃取柱中進(jìn)行萃取，萃取后得到的粗液進(jìn)行氮吹，吹干后，用甲醇進(jìn)行溶解，針管過濾，裝入檢測瓶內(nèi)，為樣品；

3)用ELISA法檢測微囊藻毒素：

將微囊藻毒素酶免檢測試劑盒取出，在室溫下放置15min以上，放置需要的微孔在反應(yīng)板的支架上，用配置好的洗滌液洗滌2次，每一次間隔時(shí)長為1min，之后拍干；設(shè)定酶標(biāo)儀調(diào)零孔為1號孔，微囊藻毒素MC-LR標(biāo)準(zhǔn)樣品對照孔為2-6號孔，其余均為待測樣品孔，分別在1-6號孔內(nèi)加入50μL濃度分別為0ng/L、100ng/L、250ng/L、500ng/L、1000ng/L、2000ng/L的標(biāo)準(zhǔn)品，在其他小孔加入對應(yīng)的待測樣品前處理液，搖勻，使用移液槍在小孔中加入50μL，搖勻，使各孔中第一抗體溶液與待測樣品混勻；在37℃、靜態(tài)的環(huán)境下，孵育60分鐘，孵育結(jié)束后，倒掉反應(yīng)板中液體，使用移液槍在每個(gè)小孔中加入約250μL洗滌液，洗液不超過小孔體積，放置1分鐘，之后甩掉洗液，于濾紙上輕輕拍干，重復(fù)操作3次；再使用移液槍在每個(gè)小孔中加入100μL酶標(biāo)二抗溶液，在37℃、靜態(tài)的環(huán)境下，搖勻，孵育30分鐘，孵育結(jié)束后，倒掉反應(yīng)板中液體，使用移液槍在每個(gè)小孔中加入250μL洗滌液，洗液不超過小孔體積，放置1分鐘，之后甩掉洗液，取新濾紙，于濾紙上輕輕拍干，重復(fù)操作5次；然后使用移液槍在每個(gè)小孔中加入50μL底物液后，再加入50μL顯色液，搖勻，在37℃、靜態(tài)的環(huán)境下顯色15分鐘，使用移液槍在每個(gè)小孔中加入50μL反應(yīng)終止液，微微搖動反應(yīng)板，并在30分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀于450nm處測得光密度OD值，測定條件為37℃、波長450nm，橫縱坐標(biāo)軸分別選擇藻毒素濃度和光密度；

4)用HPLC法檢測MC-LR濃度：

配置一系列MC-LR標(biāo)準(zhǔn)溶液，并取樣于進(jìn)樣瓶內(nèi)，在高效液相色譜儀工作站上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將處理好的樣品置于托盤，直接進(jìn)樣，由高效液相色譜儀進(jìn)行檢測，通過工作站采集檢測數(shù)據(jù)，再與標(biāo)線進(jìn)行比對，利用外標(biāo)法計(jì)算結(jié)果；

色譜分析條件：柱溫40℃，流速1mL/min，流動相：V甲醇:V水＝65：35，紫外檢測波長238nm，進(jìn)樣量10μL，色譜柱規(guī)格為Promosil 4.6mm*250mm*5μm C18；

橫縱坐標(biāo)軸分別選擇MC-LR濃度和峰面積。

4.如權(quán)利要求1所述的驗(yàn)證ELISA法和HPLC法之間存在相關(guān)性和線性關(guān)系的方法，其特征在于：所述細(xì)胞破碎儀為型號是Guava easyCyte5、默克化工技術(shù)上海有限公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀，所述高效液相色譜儀型號為LC-20A、島津(上海)公司生產(chǎn)，所述微囊藻毒素酶免檢測試劑盒為北京普華仕科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)。