[發(fā)明專利]一種15N代謝標(biāo)記蛋白質(zhì)結(jié)合質(zhì)譜平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)定量的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811314764.2
• 申請(qǐng)日: 2018-11-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109444279A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-03-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陸天聰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京蛋白世界生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72;G01N30/88
• 代理公司: 北京聯(lián)瑞聯(lián)豐知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11411
• 代理人: 蘇友娟

本發(fā)明公開(kāi)了一種¹⁵N代謝標(biāo)記蛋白質(zhì)結(jié)合質(zhì)譜平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)定量的方法，¹⁵N代謝標(biāo)記的內(nèi)參蛋白可以準(zhǔn)確地反映待檢測(cè)內(nèi)源蛋白的結(jié)構(gòu)、狀態(tài)，與待檢測(cè)蛋白具有相同的酶解效率，解決了質(zhì)譜選擇追蹤定量過(guò)程中內(nèi)參肽離子強(qiáng)度信號(hào)受蛋白酶消化、共洗脫基質(zhì)、樣品組成、儀器狀態(tài)等影響導(dǎo)致的不重現(xiàn)問(wèn)題，同時(shí)提高質(zhì)譜平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)定量的效率；另外，本發(fā)明提供的方法可以產(chǎn)生多種用于平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)的定量多肽，提高了定量準(zhǔn)確性并降低合成多肽的成本，且該方法能夠用于定量蛋白組學(xué)研究、對(duì)蛋白標(biāo)志物的檢測(cè)，醫(yī)療診斷、環(huán)境衛(wèi)生，食品安全檢測(cè)，司法鑒定等有很大的幫助。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及質(zhì)譜檢測(cè)的分析領(lǐng)域，尤其是一種¹⁵N代謝標(biāo)記蛋白質(zhì)結(jié)合質(zhì)譜平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)定量的方法。

背景技術(shù)

質(zhì)譜平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)(Parallel reaction monitoring，PRM)技術(shù)作為一種質(zhì)譜檢測(cè)的分析方法，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好、線性動(dòng)態(tài)范圍寬、自動(dòng)化、高通量的突出優(yōu)點(diǎn)，這些特質(zhì)能夠滿足今天很多研究領(lǐng)域的迫切需要。通過(guò)PRM技術(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)的定量監(jiān)測(cè)可以進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)、臨床診斷、違禁藥物檢查、食品化妝品等工業(yè)質(zhì)量控制、環(huán)境檢測(cè)、農(nóng)業(yè)植物學(xué)研究以及代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)等相關(guān)研究。

在PRM靶向追蹤定量技術(shù)中，內(nèi)參物的選擇對(duì)于靶向定量的成功至關(guān)重要。目前內(nèi)參物都采用體外化學(xué)合成穩(wěn)定同位素標(biāo)記多肽的方式完成，由于氨基酸組成與靶標(biāo)蛋白質(zhì)一致，只是穩(wěn)定同位素的引入導(dǎo)致多肽質(zhì)量發(fā)生變化，因此在一級(jí)色譜時(shí)具有相似的滯留時(shí)間，從而可利用其與樣品混合進(jìn)行目的蛋白質(zhì)的平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)。

在樣品檢測(cè)過(guò)程中摻入化學(xué)合成的內(nèi)參多肽進(jìn)行靶向追蹤，由于受到不在同一體系內(nèi)酶解、不能完全共洗脫、儀器狀態(tài)等因素影響，使得質(zhì)譜中產(chǎn)生的離子強(qiáng)度信號(hào)并不具有穩(wěn)定的可重復(fù)性。因此，最理想的靶向追蹤定量?jī)?nèi)參物應(yīng)是與靶標(biāo)組成和結(jié)構(gòu)相一致的蛋白質(zhì)，而不是體外化學(xué)合成的多肽。

基于質(zhì)譜的平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)定量的方法對(duì)臨床檢測(cè)具有很高的應(yīng)用前景，具備取代抗體檢測(cè)的潛力。但目前PRM技術(shù)仍存在許多問(wèn)題。其廣泛接受的做法之一是使用體外合成的重標(biāo)記多肽(如¹³C，³H等)來(lái)測(cè)量?jī)?nèi)源性蛋白質(zhì)。這種方法雖簡(jiǎn)單，但存在一些問(wèn)題。首先，這種方法需要前期實(shí)驗(yàn)以及大量數(shù)據(jù)分析以確定合成的目標(biāo)肽段。第二，不同批次樣品的蛋白質(zhì)酶消化過(guò)程會(huì)產(chǎn)生顯著的差異。因此，控制消化步驟是很重要的。結(jié)果表明，合成肽段不能準(zhǔn)確反映測(cè)定的內(nèi)源蛋白質(zhì)的絕對(duì)量，差異常超過(guò)10倍。第三，定量?jī)H限于與合成肽段相同的內(nèi)源肽段，而不是整個(gè)蛋白質(zhì)序列，相比蛋白靶標(biāo)，另一個(gè)缺點(diǎn)是合成多肽價(jià)格昂貴。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種¹⁵N代謝標(biāo)記蛋白質(zhì)結(jié)合質(zhì)譜平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)定量的方法，能夠更準(zhǔn)確、重現(xiàn)性地測(cè)定內(nèi)源性蛋白質(zhì)濃度。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種¹⁵N代謝標(biāo)記蛋白質(zhì)結(jié)合質(zhì)譜平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)定量的方法，包括以下步驟：

a)以¹⁵N代謝標(biāo)記內(nèi)參蛋白，得到¹⁵N標(biāo)記的蛋白；

b)向待測(cè)樣品中加入步驟a)得到的¹⁵N標(biāo)記的蛋白，并進(jìn)行電泳，得到蛋白凝膠；

c)將步驟b)得到的蛋白凝膠進(jìn)行膠內(nèi)酶解，得到酶解樣品；

d)將步驟c)得到的酶解樣品進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，并將質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果通過(guò)PRM進(jìn)行定量分析。

優(yōu)選地，所述內(nèi)參蛋白合成方式為¹⁵N代謝標(biāo)記合成

優(yōu)選地，步驟d)中質(zhì)譜檢測(cè)采用的是液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀PRM監(jiān)測(cè)。