[發明專利]一種植物雜交體系及應用

在審

• 申請號: 201811313891.0
• 申請日: 2018-11-06
• 公開（公告）號: CN109566396A
• 公開（公告）日: 2019-04-05
• 發明（設計）人: 張先文;王東芳;趙宇;沈志成
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: A01H1/02
• 分類號: A01H1/02;C12N15/82
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

本發明公開了一種植物雜交體系及應用，所述植物雜交體系由不育系、保持系和恢復系組成；所述保持系含有TWSD載體，所述TWSD載體至少同時含有5個緊密連鎖的表達框：除草劑抗性基因表達框、植物內源抗除草劑基因的沉默或敲除表達框、不育系育性恢復表達框、使得保持系種子與不育系種子相比具有肉眼可見的顏色或者形狀上的顯著差異的表達框、導致含有上述表達框的花粉不育的表達框。本發明雜交體系最大的改進是，通過結合顏色或者形狀標記技術、除草劑選擇性殺滅技術和轉基因花粉致死技術，極大的確保整個雜交體系的可靠性和穩定性，多重技術確保雜交種子的純度，平均純度從95％提高到98％。

(一)技術領域

本發明涉及一種植物雜交體系及應用。

(二)背景技術

雜交優勢的利用給糧食的增產帶來了一個飛躍式的發展。目前利用雜交優勢的途徑包括人工去雄雜交制種、化學去雄雜交制種、利用自交不親合性雜交制種、利用雄性不育系。雄性不育系在現代雜交制種應用中極為普遍，一般采用三系兩田法，即不育系、恢復系、保持系、親本繁殖田、雜交制種田。而且制種手續簡化，制種產量較高，從而降低了種子生產成本。目前應用的三系制種中的不育系主要是核質互作雄性不育，這種類型的不育性比較容易獲得三系。現已在玉米、高梁、小麥、水稻等大田作物的雜交制種中廣泛應用。然而，要獲得具有應用價值的不育系、保持系及恢復系是一項極其繁瑣、艱巨的工作。通過基因工程手段獲得雄性不育系、恢復系不僅較傳統的多代選育省時、省力，而且易于保持親本的優良性狀，有著巨大的應用前景。1990年，Mariani(Mariani,Debeuckeleer et al.1990)等利用TA29-Barnase嵌合基因的轉化，首次在世界上獲得了轉基因的不育煙草和油菜；1992年，他們又通過TA29-Barstar基因的轉化獲得了上述不育煙草和油菜的恢復系(Mariani C,Gossele V,De Beuckeleer M,et al.1992.)。此后，Reynaerts(Reynaerts A,Van deWiele H,De Sutter G,et al.Scientia Horticulturae,1993,55(1):125-139.)等又相繼獲得了轉基因的不育椰菜、萵苣等。

美國先鋒公司發明了一種雄性不育系統(TSS)。這種不育技術基于花藥特異性啟動子介導DNA腺嘌呤甲基化酶基因(dam)在植物中表達，擾亂正常花粉的發育，導致雄性不育。dam基因的表達框與篩選標記PAT(膦酸絲氨酸乙酰轉移酶)基因表達框緊密連鎖。PAT基因賦予植物耐受草銨膦的特性。當想同背景的TSS轉基因不育系與非轉基因植株雜交時，收獲的種子中50％是轉基因的雄性不育系，50％是非轉基因的可育系。在生產雜交種時，可以通過噴施草銨膦，殺滅50％的非轉基因可育系，這樣留下來的都是轉基因不育系，可以與父本雜交獲得雜交種。上述雜交種中同樣50％是非轉基因，50％是轉基因。但是在大田種植時50％的非轉基因植株產生的花粉足夠為所有的植株提供花粉。

上述基于barnase基因的方法和TSS方法都需要較大的增加成本，而且生產上應用也非常復雜，比如基于barnase基因的方法需要分別對不同的父母本進行回交轉育，而且最終產品中含有barnase和barstar兩種外源蛋白，需要進行大量安全評價工作；而TSS方法生產獲得的最終產品中一半是轉基因種子，一半是非轉基因種子。因此，無論是TSS還是基于barnase的方法都沒有再商品化雜交玉米種子生產中大量應用。

大概十年前，美國先鋒公司研發了一種種子生產技術(Seed ProductionTechnology/SPT)。這個技術基于玉米自身的核雄性不育基因Ms45和顏色標記技術，即在Ms45突變不育系中導入一個3個表達框緊密連鎖的DNA片段，3個表達框分別是胚乳中特異性表達紅色蛋白的表達框、恢復育性的正常Ms45基因表達框和殺滅含有上述兩個表達框的花粉的表達框。上述含有SPT片段的玉米植株產生非轉基因花粉，獲得的種子中50％是紅色，可育的，50％是正常顏色，雄性不育的。因此，不育系種子可以用來繁殖不育系種子或者用來生產雜交種，而紅色的SPT種子可以用來繁殖SPT種子或者用來為不育系提供花粉，生產不育系種子。