[發(fā)明專利]一種建蘭莖腐病菌LAMP檢測引物組及其快速檢測方法

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• 申請日: 2018-11-06
• 公開（公告）號: CN109182591A
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姚錦愛;余德億;黃鵬;陳南川
• 申請（專利權(quán)）人: 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/77
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

本發(fā)明提供了一種建蘭莖腐病菌LAMP檢測引物組及其快速檢測方法。用于檢測建蘭莖腐病菌的LAMP引物組由1對外側(cè)引物F3/B3和1對內(nèi)側(cè)引物FIP/BIP組成，F(xiàn)3/B3和FIP/BIP引物序列如SEQ ID.1?4所示。包括以下步驟：1）提取待測樣品DNA；2）進(jìn)行LAMP擴(kuò)增；3）使用熒光染料SYBR Green I對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行顯色或瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。本發(fā)明能快速、方便、高效、高特異、高靈敏地檢測到建蘭莖腐病菌，不需要復(fù)雜昂貴的儀器，能較好地滿足對建蘭莖腐病菌的現(xiàn)場快速檢測，可廣泛應(yīng)用于基層單位田間病害的早期診斷和病菌的監(jiān)測、鑒定，為防治建蘭莖腐病提供可靠的技術(shù)和理論依據(jù)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于園藝作物病害檢測、鑒定及防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種建蘭莖腐病菌LAMP檢測引物組及其快速檢測方法，可用于建蘭莖腐病菌快速、靈敏和特異的分子檢測，以及建蘭莖腐病的早期診斷和病菌的監(jiān)測和鑒定。

背景技術(shù)

莖腐病是建蘭生產(chǎn)上最嚴(yán)重的一種世界性土傳病害，有“蘭花癌癥”和“蘭花殺手”之稱，其致病菌為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。自2010年馬來西亞檳城首次報(bào)道之后，世界各地的蘭花種植區(qū)普遍發(fā)生。該病是一種由土壤傳染，從根或根莖部或傷口侵入，在維管束內(nèi)寄生的系統(tǒng)性病害，是建蘭生產(chǎn)上較難防治的病害之一，該病由于具有發(fā)病快、病害重、傳播迅速等特點(diǎn)，一旦發(fā)生常造成經(jīng)濟(jì)巨大損失。此病的初侵染源主要是帶病菌的土壤、病株殘?bào)w、種子和糞肥等，病菌從腐爛的寄主組織里散布到土中可營腐生活，存活時(shí)間長達(dá)5～6年或更長的時(shí)間。莖腐病菌可借助雨水、灌溉水等進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，整個(gè)生長期均能發(fā)生。隨著農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整和設(shè)施栽培技術(shù)的不斷發(fā)展，建蘭種植的面積也越來越大，近年來莖腐病有進(jìn)一步加重的趨勢，一般可導(dǎo)致產(chǎn)量減少20%～40%，甚至全株枯死，導(dǎo)致絕收，嚴(yán)重影響產(chǎn)量和品質(zhì)。由于莖腐病是一種土傳病害，防治上主要以預(yù)防為主，防治是否及時(shí)，直接影響了對土傳病害的防治效果。因此生產(chǎn)上迫切需要建立一種快速、準(zhǔn)確的檢測建蘭莖腐病的方法，為病害的早期診斷與防治、監(jiān)測、預(yù)測預(yù)報(bào)提供支持和服務(wù)，對發(fā)展建蘭甚至蘭花生產(chǎn)、增加花農(nóng)收入、減少環(huán)境污染和維持農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，都具有重大的生產(chǎn)意義。

當(dāng)前，病原菌的檢測方法較多，傳統(tǒng)真菌菌種鑒定方法主要以形態(tài)學(xué)為依據(jù)，將菌種鑒定到綱、目、科、屬、種。真菌的形態(tài)特征復(fù)雜，且有些菌類形態(tài)特征和生理生化特征隨著環(huán)境的變化而不穩(wěn)定，因此，在傳統(tǒng)的真菌分類中常引起分類系統(tǒng)的不一致。同時(shí)傳統(tǒng)分類鑒定方法耗時(shí)長、靈敏度低、易受人為及環(huán)境等諸多因素的干擾，不能直觀的在病害潛伏期和初發(fā)期做出診斷，很難對病害發(fā)生進(jìn)行及時(shí)的監(jiān)測和有效控制。

隨著生物化學(xué)、遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)的發(fā)展，為病原菌的分類鑒定提供了技術(shù)條件。如血清學(xué)免疫學(xué)技術(shù)、常規(guī)PCR、巢式PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等技術(shù)為病原菌的分類鑒定提供了靈敏度高、快速的檢測技術(shù)。但這些分子生物學(xué)技術(shù)在一定程度上也存在了一些不足之處，如血清免疫學(xué)檢測技術(shù)在血清的制備過程耗時(shí)耗力，常常受到抗血清質(zhì)量的影響，且可能存在交叉反應(yīng)，特異性較差，容易造成假陽性，PCR快速檢測技術(shù)主要包括常規(guī)PCR、巢式PCR（Nest-PCR）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 等，PCR技術(shù)檢測時(shí)間較長，需要依賴貴重、精密的PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)等貴重儀器設(shè)備及相應(yīng)的高新技術(shù)人員，因而提高了檢測成本，并限制了其應(yīng)用范圍，不利于基層生產(chǎn)上推廣應(yīng)用，限制了這些先進(jìn)方法的推廣應(yīng)用。