[發明專利]單細胞線粒體拷貝數檢測方法

在審

• 申請號: 201811312082.8
• 申請日: 2018-11-06
• 公開（公告）號: CN109207562A
• 公開（公告）日: 2019-01-15
• 發明（設計）人: 孫瑩璞;張玫翔;姚桂東;馬雪山;徐家偉
• 申請（專利權）人: 鄭州大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/6827
• 分類號: C12Q1/6827
• 代理公司: 鄭州豫開專利代理事務所(普通合伙) 41131
• 代理人: 朱俊峰

1.單細胞線粒體拷貝數檢測方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）、探針和引物設計：針對線粒體DNA11778位點設計相應的引物，首先在線粒體DNA11778位點上下游序列設計一對產物約為1000bp的引物作為用于標準品制作的引物（序列1和序列2）；針對線粒體DNA11778位點G>A突變，設計一對Taqman探針，包括不帶突變VIC探針（序列3）、攜帶突變的FAM探針（序列4）以及探針所需的引物（序列5和序列6），

引物序列如下：

序列1：CAACAACCTATTTAGCTGTTCCCC；

序列2：GTAAGGCGAGGTTAGCGAGG；

序列3：CACAGTCGCATCATA（熒光基團為VIC，猝滅基團為MGB的Taqman探針）；

序列4：ACTCACAGTCACATCA（熒光基團為FAM，猝滅基團為MGB的Taqman探針）；

序列5：GCTTACATCCTCATTACTATTCTGCCTA；

序列6：GAGTAGAGTTTGAAGTCCTTGAGAGAG；

（2）、雙標準品建立：正常人的血液標本和患者的血液標本提取DNA后測定濃度，建立濃度25-50ng/mL的模板DNA，利用引物序列1和引物序列2進行普通PCR擴增，反應體系如下：2′Hot Start Master Mix 25mL，引物序列1（10mM）1mL，引物序列2（10mM）1mL，模板DNA (總量50-100ng) 2mL，水21mL，總體積50mL；反應在ABThermalCycler上進行，反應程序如下：95°C2min→95°C30sec→63°C30sec→72°C1min，以上反應程序反復進行30個循環，接著為72°C10min，最后4°C保存；

PCR產物跑膠檢測條帶均一性，制作1.5%瓊脂糖凝膠，以1：1000的比例加入GelRed，跑膠后可見971bp單一條帶，割膠回收，提取DNA，根據DNA濃度和片段長度代入公式計算拷貝數：

拷貝數(拷貝/ uL)= [DNA濃度ng/mL] × 6.0221409×10²³

[片段長度bp] × 650 × 10⁹

通過加水稀釋DNA，分別建立正常和患者10⁹拷貝/ mL至 10²拷貝/mL共16個標準品；

（3）、Taqman雙標準曲線建立:準備上述的16個樣本，以及不同比例混合的患者和正常人的DNA，采用Taqman方法進行標準曲線的建立和比例校準；

Taqman反應體系如下：2′Taqman Universal Master Mix (With UGI) 5mL，引物序列3（10mM）0.2mL，引物序列4（10mM）0.2mL，標準品DNA 1mL，水3.2mL，總體系10mL，反應在LifeQuantStudio 12K Flex熒光定量PCR系統上進行，反應程序如下：首先是擴增過程：95°C2min→95°C 30sec→63°C 30sec→72°C 1min，以上反應程序進行30個循環；然后72°C10min，接著進行熔解曲線過程，檢測產物特異性；

結果表明，各個反應管均出現特異性擴增，VIC和FAM兩種熒光能夠準確指示樣本線粒體DNA11778位點所含的堿基是G（VIC）還是A（FAM），所測結果呈現梯度分布，與標準品制作時所設定的梯度一致；

正常對照VIC：y = -3.480x + 35.84，R2 = 0.940 式（1）；

患者突變FAM：y = -3.498x + 36.04，R2 = 0.998 式（2）；

（4）、單細胞裂解：首先配制單細胞專用裂解液，配制方法如下：

單細胞專用裂解液10mL：包含KCL 0.0373g (分子量=74.55，終濃度50mM)、MgCl20.0019g (或0.02mL 1M MgCl2，分子量=95.21，終濃度1.5mM)、0.1mL 1M Tris-HCl (Tris分子量=121.14，終濃度10mM) 、明膠 0.001g （明膠無固定分子量，終濃度0.1mg/ml）、0.064mL 70% NP-40（終濃度0.45%）、0.045mL Tween 20（終濃度0.45%）、新鮮蛋白酶K1.2mg (終濃度0.12mg/mL)，隨后補充純水至10mL；

將單細胞、卵裂球、胚胎樣本放入2mL單細胞專用裂解液中，震蕩離心，55℃裂解2小時（或55℃過夜），95℃15min使裂解液失活，裂解完成后以14000轉離心5min，取上清可直接用于Taqman體系進行檢測，獲得Ct值；

（5）、單細胞線粒體拷貝數計算；

對于僅含有正常序列的樣本，根據式（1），代入VIC的Ct值y，計算一個反應體系中的正常序列的拷貝數；

對于攜帶突變的樣本，根據式（1）和式（2），代入VIC和FAM的Ct值y，計算正常序列和突變序列的拷貝數，進而通過以下公式計算比例：突變比例=突變序列拷貝數/(正常序列拷貝數+突變序列拷貝數)。