[發明專利]一種簡易的斑點雜交加樣方法

在審

• 申請號: 201811311187.1
• 申請日: 2018-11-06
• 公開（公告）號: CN109504742A
• 公開（公告）日: 2019-03-22
• 發明（設計）人: 曹祖兵;王怡青;童旭;張丹丹;寧偉;齊昕;許騰騰;高迪;張運海
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12Q1/6834
• 分類號: C12Q1/6834
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 沈尚林

1.一種簡易的斑點雜交加樣方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)豬耳緣成纖維細胞的培養；

(2)細胞RNA的提取、濃度的測定以及調整；

(3)添加樣品：預熱金屬浴至85℃，并將硝酸纖維素膜裁剪至所需要的合適大小；通過美紋紙將硝酸纖維素膜固定于層板上；在硝酸纖維素膜上于85℃烘烤下進行加樣；加樣后用重物壓住層板，以使硝酸纖維素膜和金屬浴緊密接觸；

(4)進行斑點雜交；

(5)分析結果，比較灰度值。

2.根據權利要求1所述的簡易的斑點雜交加樣方法，其特征在于，步驟(1)中，豬耳緣成纖維細胞培養的具體步驟如下:

①解凍兩管凍存于液氮中的豬耳緣成纖維細胞于兩個直徑9cm的培養皿中，在溫度為37℃，CO₂體積分數為5％的平衡箱中培養；

②培養一定時間后，在顯微鏡下觀察，待貼壁的細胞面積達到皿底面積的95％時，對照組更換新的培養基，試驗組更換含有濃度為20mM的環亮氨酸的培養基，繼續在平衡箱中培養48h。

3.根據權利要求1所述的簡易的斑點雜交加樣方法，其特征在于，步驟(2)中，細胞RNA的提取、濃度的測定以及調整的具體步驟如下：

①在顯微鏡下觀察對照組和試驗組的細胞是否生長良好，若細胞表現為貼壁，且面積達到皿底面積的95％，則進行RNA的提取；

RNA的提取分三組，分別是：

293T-作為陽性對照，作用是用于檢測樣品是否附著于硝酸纖維素膜上，以及成像是否正常等；

對照組-用作空白對照的豬耳緣成纖維細胞；

試驗組-添加環亮氨酸處理48h之后的豬耳緣成纖維細胞；

②先提取RNA，對三組RNA的濃度進行測定，再調整RNA濃度，使得三組RNA的濃度一致；

③提取293T細胞的RNA具體過程如下，其他兩組RNA提取方法與之相同：

a.預處理：將無RNA酶的槍頭放入超凈臺中紫外照射30min，打開金屬浴55℃，預熱DEPC水；

b.將293T細胞的培養液PAF棄掉，然后用PBS清洗兩遍，棄掉PBS后加入1mL的Trizol裂解細胞；

c.將裝有RNA樣品的1.5mL離心管放在渦旋震蕩儀上震蕩30s-60s，隨后置于冰上靜止2min；

d.將裂解后的細胞-Trizol混合物移入1.5mL離心管中，再加入400μL的氯仿，迅速混勻，震蕩2min，然后迅速插在冰上靜止，隨后在4℃下，轉速13000rpm離心10min，離心后，將該離心管靜置于冰上，用吸取上層水相清液，將清液置于另一1.5mL離心管中，并放于冰上；

e.向上步裝有清液的離心管中加入40μL異丙醇，充分混勻后置于-80℃冰箱30min后取出，在4℃下，轉速12000rpm離心15min；

f.棄掉上步的上層清液，留下底部白色沉淀，加入體積分數為75％的RNAse free乙醇800μL洗滌沉淀，4℃下，轉速12000rpm離心10min；

g.重復上述步驟一次；

h.將離心管在4℃下轉速為12,000rpm離心2min，將剩余的75％RNAse free乙醇吸走，留下沉淀，再靜置2min以確保乙醇完全揮發；

i.取31μL加熱至55℃的DEPC水于上步的RNA沉淀中，用移液器吹打混勻至沉淀完全溶解后，吸取1μL于分光光度計中，測量濃度并記錄相關數值；

j.將所有組的RNA樣品的濃度調一致，用于斑點雜交。

4.根據權利要求1所述的簡易的斑點雜交加樣方法，其特征在于，步驟(4)中，斑點雜交的具體步驟如下：

①RNA變性：使三組RNA樣品在95℃下變性10min，以破壞其二三級結構，然后迅速置于冰上冷卻2min，使其結構穩定在一級結構；

②在進行步驟①的同時將硝酸纖維素膜于金屬浴85℃中預熱，待步驟①的RNA樣品處理好之后用無RNA酶的槍頭進行梯度加樣，第一排點1μL，第二排點2μL，然后85℃烘烤6h；

③將梯度加樣后的三組RNA樣品于水平搖床中用質量分數為5％的BSA常溫封閉2h；

④加m6A一抗于5％BSA中，按1:5000的體積比進行稀釋，置于4℃搖床上12h以上；

⑤次日早晨，常溫下在水平搖床中用1XPBST洗一抗，6次，6min/次；

⑥將二抗以3:10000的體積比進行稀釋于水中,再將該稀釋后的二抗與質量分數為5％的牛奶混合，水平搖床，常溫，105min；

⑦常溫下在水平搖床中用1XPBST洗二抗，5次，5min/次；

⑧配制顯影液，將NcmECL Ultra Enhancer Reagent(A)和NcmECL Ultra Stabilizedperoxide Reagent(B)按體積比例1:1混合；

⑨進行放射自顯影。