[發(fā)明專利]一種基于銀納米簇猝滅效應(yīng)和多重放大技術(shù)的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811306301.1
• 申請(qǐng)日: 2018-11-05
• 公開（公告）號(hào): CN109444117A
• 公開（公告）日: 2019-03-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 接貴芬;葛君君;王衛(wèi)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 青島科技大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/76
• 分類號(hào): G01N21/76;G01N27/48
• 代理公司: 青島中天匯智知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37241
• 代理人: 郝團(tuán)代

1.一種基于銀納米簇雙重猝滅效應(yīng)和多重循環(huán)放大技術(shù)的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器，其特征是：通過目標(biāo)ATP與其適體結(jié)合以及酶聚合剪切作用實(shí)現(xiàn)多重循環(huán)放大反應(yīng)，生成大量DNA產(chǎn)物鏈，將原位合成Ag NCs的DNA接到電極上，實(shí)現(xiàn)電極上CdS量子點(diǎn)與Ag NCs與之間的ECL能量轉(zhuǎn)移以及Ag NCs對(duì)電極表面附近的共反應(yīng)劑的消耗，從而構(gòu)建電化學(xué)發(fā)光生物傳感器。

2.一種制備權(quán)利要求1所述的基于銀納米簇雙重猝滅效應(yīng)和多重循環(huán)放大技術(shù)的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的方法和應(yīng)用，其特征方法由下列步驟組成：

步驟1.CdS量子點(diǎn)的制備：采用水熱合成方法合成了CdS量子點(diǎn)作為信號(hào)材料，在三口燒瓶中將5mmol的CdCl₂·2.5H₂O溶解于30mL二次水中，加入20μL MPA，生成白色的沉淀，之后用1.0M的NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH為10～11，此過程中溶液的沉淀逐漸溶解，接著通氮?dú)獬?0min，然后將新配制的0.02M的Na₂S溶液20mL溶液逐滴地加入上述反應(yīng)溶液中，得到橙黃色的沉淀，繼續(xù)通氮?dú)猓３址磻?yīng)溫度在70℃，反應(yīng)3h之后停止加熱，即得羧基修飾的CdS量子點(diǎn)，待反應(yīng)液自然冷卻至室溫之后收集置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

步驟2.目標(biāo)引發(fā)酶輔助循環(huán)放大反應(yīng)：首先配制一定濃度梯度的ATP溶液，為10pM，1pM，100fM，10fM，1fM，100aM，10aM，1aM，0.1aM的目標(biāo)物溶液，置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

然后，分別幾個(gè)在反應(yīng)管中加入10μL(1μM)HP1，再分別加入10μL各個(gè)濃度的ATP，混合均勻之后置于恒溫震蕩期中反應(yīng)30min，之后，在反應(yīng)管內(nèi)加入1μM的template DNA鏈10μL，10μL的dNTPs，5U phi29聚合酶和5U Nt.BbvCI內(nèi)切酶以及各自對(duì)應(yīng)的緩沖液，混合均勻之后在在搖床里37℃溫度下反應(yīng)90min，接下來將反應(yīng)管放在60℃的水浴環(huán)境中進(jìn)行酶的滅活，最后置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

步驟3 銀納米簇的制備：先配置0.02M的AgNO₃的溶液，按照DNA與Ag⁺比例為1:10的比例將200μL的10μM的銀序列與1μL的AgNO₃混合，在渦旋混合器上劇烈混合90s，再將反應(yīng)管在4℃條件下反應(yīng)30min。然后將新配制的0.01M的NaBH₄取1μL加入到反應(yīng)管內(nèi)，繼續(xù)用渦旋混合器劇烈混合90s，最后將反應(yīng)管繼續(xù)放置于4℃的環(huán)境中，反應(yīng)過夜，即可得到在templateDNA上生成的銀納米簇。

步驟4 生物傳感器的制備：傳感器制備之前，首先進(jìn)行電極的處理。將金電極用0.3μm的氧化鋁粉進(jìn)行表面的拋光處理，之后用二次水將電極表面殘留的氧化鋁粉沖洗干凈，最后在二次水浴中超聲10min，最后吹干備用。

取制備的CdS量子點(diǎn)溶液，加入乙醇之后，6000rpm下離心5min，之后將沉淀收集，除去上層液體，將沉淀重新溶于等量的二次水中；用移液槍取10μL的量子點(diǎn)溶液均勻地滴在電極的表面，在室溫下避光自然晾干，在電極表面形成一層薄膜，即得CdS修飾的金電極；接下來，將電極浸入含有EDC(20mg/mL)和NHS(10mg/mL)的溶液中，進(jìn)行量子點(diǎn)表面羧基的活化處理，反應(yīng)時(shí)間1h；反應(yīng)之后，用PBS輕輕沖洗電極表面，以除去殘余的EDC和NHS，然后將10μL的HP2(1μM)滴到電極的表面，在濕潤(rùn)的環(huán)境下避光反應(yīng)4h以使HP鏈末端的氨基和量子點(diǎn)表面的羧基結(jié)合；反應(yīng)之后，用PBS小心地沖洗電極表面，將沒有連接的DNA除去然后用MCH進(jìn)行封板處理1h，最后再進(jìn)行電極沖洗。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ATP檢測(cè)方法，其特征是：所述的電化學(xué)發(fā)光測(cè)試是將表面進(jìn)行反應(yīng)完成的電極作為工作電極，三電極體系中檢測(cè)ECL信號(hào)。ECL檢測(cè)液為pH為7.4的PBS溶液(0.1M)，含有K₂S₂O₈(0.1M)和KCl(0.1M),其中K₂S₂O₈作為共反應(yīng)劑與量子點(diǎn)發(fā)生反應(yīng)，檢測(cè)電壓范圍為0～-1.5V，掃描速率為0.1V/s，光電倍增管為-600V到-800V。同時(shí)采用統(tǒng)一的光電倍增條件，在光窗上加蓋不同波長(zhǎng)的濾光片(400nm，425nm，440nm，460nm，490nm，535nm，555nm，575nm，620nm)，檢測(cè)ECL發(fā)光強(qiáng)度在不同的波長(zhǎng)內(nèi)的變化。