[發明專利]一種重組基因VIII型新城疫病毒弱毒株

在審

• 申請號: 201811306286.0
• 申請日: 2018-11-05
• 公開（公告）號: CN109321534A
• 公開（公告）日: 2019-02-12
• 發明（設計）人: 曹永忠;張小榮;阮寶陽;吳艷濤
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

本發明涉及獸醫病毒分子生物學技術和免疫學技術領域，公開了一株重組基因Ⅷ型新城疫病毒弱毒株NDV?rHR09?LaSota?HN。所述的弱毒株NDV?rHR09?LaSota?HN的保藏號為CCTCC NO:V201830。研究表明，NDV?rHR09?LaSota?HN毒株毒力弱，MDT大于120h，ICPI值為0.026，免疫試驗證明對新城疫強毒株有良好的免疫保護效果，經與常用疫苗株LaSota對照，以NDV?rHR09?LaSota?HN株接種1日齡SPF雞，3周后雞的抗體水平、對流行強毒株攻毒的保護效果等優于或不低于對照組。

技術領域

本發明涉及獸醫病毒分子生物學技術和免疫學技術領域，利用反向遺傳操作平臺對篩選獲得的基因Ⅷ型毒株在F基因突變的基礎上再進行HN基因片段的替換，獲得了一株重組的基因VIII型新城疫病毒弱毒株。

背景技術

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)對世界家禽養殖業危害巨大，它可以感染多種禽類，常導致養禽業產生巨大的經濟損失[Alexander,D.J.2001.GordonMemorial Lecture.Newcastle disease.Br Poult Sci 42:5-22.]。該病毒在分類學上屬于副粘病毒科、副粘病毒亞科、禽腮腺炎病毒屬(Avulavirus)的成員[Mayo,M.A.2002.Virus taxonomy-Houston 2002.Arch Virol 147:1071-1076.]。新城疫病毒有囊膜，基因組為單股、負鏈、不分節段的RNA病毒，基因組結構模式為：3′-NP-P-M-F-HN-L-5′，依次編碼6種結構蛋白：核衣殼蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神經氨酸酶蛋白(HN)和大分子蛋白(L)即核蛋白(NP)，P，M，F，HN和L蛋白。根據對雞的毒力，NDV毒株可以為強毒(Velogenic)、中等毒力(Mesogenic)和弱毒(Lentogen)三種類型。已有大量的研究已經闡明了病毒致病性的分子決定因素[Huang Z,Krishnamurthy S,Panda A,Samal SK.Newcastle disease virus V protein is associated with viralpathogenesis and functions as an alpha interferon antagonist.Journal ofvirology 2003Aug；77(16):8676-85.]，其中大部分是關于F和HN蛋白對病毒毒力的作用，特別是F蛋白裂解位點處的氨基酸序列是病毒毒力的主要決定因素[Seal BS.Nucleotideand predicted amino acid sequence analysis of the fusion protein andhemagglutinin-neuraminidase protein genes among Newcastle disease virusisolates.Phylogenetic relationships among the Paramyxovirinae based onattachment glycoprotein sequences.Funct IntegrGenomics 2004Oct；4(4):246-57.]。NDV毒力差異的分子基礎主要決定于F0蛋白的蛋白酶裂解位點的氨基酸序列，強毒的裂解位點兩端有成對的堿性氨基酸序列，其模式基序為¹¹²R/K-R-Q-K/R-R-F¹¹⁷；弱毒的裂解位點則缺少聚堿性氨基酸序列，其模式基序為¹¹²-E/G-R/K-Q-E/G-R-L¹¹⁷。HN蛋白也是NDV毒力的重要決定因素。已有的研究證明，HN蛋白氨基酸序列的長短與毒力有關，利用反向遺傳操作技術，Roemer-Oberdoerfer等已證實HN蛋白的不同長度與NDV的毒力和致病性有著非常重要的關系(Roemer-Oberdoerfer A,Werner O,Veits J,et al.Contribution of thelength of the HN protein and the sequence of the F protein cleavage site toNewcastle disease virus pathogenicity.J Gen Virol.2003,84(11):3121-3129.)。HN基因編碼區的長度有多種類型，所編碼的HN蛋白長度有616、585、581、580、578、577、572、571個氨基酸等多種。含有616個氨基酸的HN前體蛋白只存在于無毒力的毒株中，如D26、Ulster和Queensland等毒株，在強毒株中未發現，而含有571個氨基酸的HN蛋白只存在于強毒株中，其它長度的HN蛋白在強弱毒株中均存在。