[發明專利]用于人類基因組成熟tRNA譜檢測的接頭、引物組和試劑盒

有效

• 申請號: 201811302188.X
• 申請日: 2018-11-02
• 公開（公告）號: CN109306373B
• 公開（公告）日: 2021-11-26
• 發明（設計）人: 歐旭敏;潘秋衛;程安春;汪銘書;朱德康
• 申請（專利權）人: 四川農業大學;西北民族大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 成都玖和知識產權代理事務所(普通合伙) 51238
• 代理人: 胡琳梅

1.用于人類基因組成熟tRNA譜檢測的引物組，其特征在于，包括表1中如SEQ ID NO.2～115所示的57對引物：

表1.用于人類基因組成熟tRNA譜檢測的引物組

其中，R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，V＝A/C/G，D＝A/G/T，N＝A/C/G/T。

2.用于人類基因組成熟tRNA譜檢測的試劑盒，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的接頭和權利要求1所述的引物組。

3.一種非疾病診斷目的的人類基因組成熟tRNA譜檢測方法，其特征在于，具體步驟如下：

(1)抽提總RNA的同時，tRNA去氨基酸；

(2)將步驟(1)所得抽提總RNA與核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示接頭混合，孵育，得含有連接tRNA的混合液；

(3)將步驟(2)所得混合液與特異性下游引物混合物混合配置成退火溶液，連接tRNA退火化；所述特異性下游引物混合物為權利要求2所述引物組中的下游引物混合物；

(4)退火化的連接tRNA與mRNA共反轉錄；

(5)qPCR檢測；

步驟(2)中，孵育的具體方法如下：

(2-1)配置退火溶液，90℃孵育3分鐘；

(2-2)加入退火緩沖液，37℃孵育20分鐘；

(2-3)配置連接反應體系，37℃孵育60分鐘；

步驟(5)中，qPCR的反應體系如下：2×SYBR^TM Green PCR Master Mix 5μl，cDNA 2μl，10pm上游引物混合物0.25μl，10pm下游引物混合物0.25μl，雙蒸水2.5μl，tRNA譜檢測的引物組序列如權利要求1中表1所示；反應程序如下：95℃預變性30s，95℃變性10s，58.3℃退火延伸30s，72℃延伸30s，45次循環，95℃、60s，65℃、60s，65-95℃、15s，每個循環增加0.3℃。

4.根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，步驟(1)中，總RNA抽提過程中，洗脫前加入10μl脫?；彌_液在37℃孵育40分鐘，然后加入20μlTE緩沖液洗脫，即可在總RNA抽提的同時實現tRNA去氨基酸。

5.根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，步驟(3)中，退火化的條件為：65℃孵育5分鐘，立即冰上孵育5分鐘。

6.權利要求1所述引物組或權利要求2所述試劑盒在非疾病診斷目的的人類基因組成熟tRNA譜檢測中的應用。