[發明專利]一種提取、分離和培養同體異種肝原代細胞的方法

在審

• 申請號: 201811301617.1
• 申請日: 2018-11-02
• 公開（公告）號: CN109385394A
• 公開（公告）日: 2019-02-26
• 發明（設計）人: 羅勇;鄧九;高志剛;趙偉杰;林炳承
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 大連星海專利事務所有限公司 21208
• 代理人: 王樹本;徐雪蓮

1.一種提取、分離和培養同體異種肝原代細胞的方法，其特征在于包括以下步驟：

步驟1、將嚙齒動物麻醉后，開腹，使用留置針肝門靜脈插管，灌流液經肝門靜脈原位37℃恒溫灌注5-30min，灌流速度為5-25mL/min，且灌流過程中不得產生任何氣泡，所述灌流液選自額外添加終濃度為0.5-10mM EGTA和1-50mM HEPES的緩沖液，所述緩沖液選自不含Ca²⁺，Mg²⁺的HBSS或D-Hanks或PBS中的一種；

步驟2、替換灌流液，將消化液經肝門靜脈原位37℃恒溫灌注2-15min，灌流速度為5-20mL/min，所述消化液選自額外添加終濃度為50-300mg/L CaCl₂、1-50mM HEPES、10-100mg/L膠原酶、0-100U/mL青霉素和0-100U/mL鏈霉素的基礎培養基，所述膠原酶選自Ⅱ型或Ⅳ型膠原酶中的一種，所述基礎培養基選自市售的DMEM-高糖，DMEM-低糖或1640中的一種；

步驟3、將步驟2中消化后的肝臟小心取出置于盛有分離液的器皿中，用鑷子小心劃破肝臟表面的包膜，鈍性分離，輕輕涮動以釋放出包含多種肝原代細胞的細胞懸液并過篩，所述分離液選自額外添加終濃度為0.05-5μM地塞米松和2％-10％FBS的基礎培養基，所述基礎培養基選自市售的DMEM-高糖、DMEM-低糖或1640中的一種，所述過篩選自孔徑為20-200μm的組織篩或紗布中的一種；

步驟4、將步驟3制得的細胞懸液加入離心管中，500-800rmp/min離心1-5min后，獲取上清液，沉淀用細胞分離液重懸，500-800rmp/min離心1-5min后，獲得實質細胞，再將實質細胞立即重懸于專門配制的實質細胞培養基中培養，所述專門配制的實質細胞培養基選自額外添加終濃度為2％-10％FBS、0-100U/mL青霉素、0-100U/mL鏈霉素、1-10mM L-谷氨酰胺和10-100nM地塞米松的Williams E培養基；

步驟5、向50mL的離心管中加入10-20mL濃度為20％-50％的percoll溶液，再加入5-15mL濃度為10％-20％的percoll溶液，最后加入10-20ml步驟4中獲取的上清液，之后1500-2000rmp/min離心10-20min，形成上、下兩層界面，分別獲取上層界面中和下層界面中的細胞；其中上層界面中所獲取細胞為星狀細胞，立即重懸于專門配制的星狀細胞培養基中培養，下層界面中的細胞懸液經1000-3000rmp/min離心15-20min，用分離液重懸，平均分成兩份備用，所述專門配制的星狀細胞培養基選自額外添加終濃度為2％-10％FBS、0-100U/mL青霉素、0-100U/mL鏈霉素和1-10mM L-谷氨酰胺的DMEM培養基；

步驟6、將步驟5中所制備的兩份備用細胞懸液100-1000rmp/min離心2-8min后，之后重懸于磁珠分選的緩沖液中，分別與連接有肝血竇內皮細胞和枯否細胞特異性的免疫磁珠孵育0.5-5h，緩慢添加至分選柱中，分選柱置于磁場中，待細胞懸液全部流干，移出磁場，再將吸附在分選柱上的細胞采用磁珠分選專用緩沖液沖洗下來，之后100-1000rmp/min離心1-10min，分別獲得肝血竇內皮細胞和枯否細胞，并立即重懸于對應的專門配制的培養基中培養，專門配制的肝血竇內皮細胞培養基選自額外添加終濃度為2％-10％FBS，0-100U/mL青霉素、0-100U/mL鏈霉素、1-10mM L-谷氨酰胺、10-100nM地塞米松和1-50ng/mL VEGF的1640培養基，專門配制的枯否細胞培養基選自額外添加終濃度為2％-10％FBS、0-100U/mL青霉素、0-100U/mL鏈霉素和1-10mM L-谷氨酰胺的1640培養基，所述肝血竇內皮細胞特異性的免疫磁珠選自市售的Anti-CD146或Anti-CD31抗體偶聯磁珠中的一種，所述枯否細胞特異性的免疫磁珠選自市售的Anti-CD14、Anti-GFAP或Anti-F4/80抗體偶聯磁珠中的一種；

提取、分離后的4種肝原代細胞是放置在溫度為37℃，CO₂含量為5％，濕度為95％的細胞培養箱中培養。