[發明專利]一種基于RPA技術用于檢測河蟹布尼亞病毒的引物及檢測方法

在審

• 申請號: 201811301320.5
• 申請日: 2018-11-02
• 公開（公告）號: CN109295259A
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發明（設計）人: 沈懷舜;臧亞南;胡亞成
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院淡水漁業研究中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12R1/93
• 代理公司: 蘇州國誠專利代理有限公司 32293
• 代理人: 李思睿

1.一種基于RPA技術用于檢測河蟹布尼亞病毒的引物，其特征在于：所述引物包括上游引物RPA ESBV-1F和下游引物RPA ESBV-1R，所述上游引物RPA ESBV-1F的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述下游引物RPA ESBV-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一種根據權利要求1所述引物在檢測或輔助檢測河蟹布尼亞病毒中的應用。

3.一種基于RPA技術檢測或輔助檢測河蟹布尼亞病毒的RPA試劑盒，其特征在于：所述RPA試劑盒包括權利要求1所述的引物。

4.一種基于RPA技術檢測或輔助檢測河蟹布尼亞病毒的方法，具體包括以下步驟：

(1)cDNA制備：從待測河蟹肝胰臟或其他河蟹組織中提取病毒RNA，然后反轉錄成cDNA備用；

(2)RPA擴增及瓊脂糖凝膠電泳：以步驟(1)中制備的cDNA作為模板，用權利要求3所述的RPA試劑盒進行RPA擴增，用瓊脂糖凝膠電泳檢測RPA擴增產物大小；

(3)結果判定：若所述RPA擴增產物含有大小為160bp的片段，則所述待測河蟹中含有了布尼亞病毒，若所述RPA擴增產物不含有大小為160bp的片段，則所述待測河蟹中不含有布尼亞病毒。

5.根據權利要求4所述的一種基于RPA技術檢測或輔助檢測河蟹布尼亞病毒的方法，其特征在于：

所述步驟(2)RPA擴增及瓊脂糖凝膠電泳的具體步驟如下所示：

(1)配制47.5μl的混合反應液，包括29.5μl Rehydration Buffer,10μM的上游引物2.4μl，10μM的下游引物2.4μl，模板cDNA 1μl和dH₂O 12.5μl；

(2)混合液混勻后轉移至含有凍干酶粉的反應單元管中，用移液槍混勻，使管中顆粒全部懸浮，加入280mM醋酸鎂溶液2.5μl，蓋上管蓋，快速混勻，在39℃金屬浴反應4min，4min結束后，取出，劇烈翻轉8-10次，混勻，重新放入金屬浴上反應40min；RPA反應結束后，向RPA擴增產物中加入50μL苯酚/氯仿(1∶1)溶液，充分混勻后，11,000×g離心3min，取上清液10μL于1.0％瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠電泳檢測電壓180V，電流250A，檢測時間20min，在凝膠成像系統上觀察結果。