[發明專利]一種卡拉洛爾人工抗原的合成方法

在審

• 申請號: 201811300547.8
• 申請日: 2018-10-30
• 公開（公告）號: CN109336965A
• 公開（公告）日: 2019-02-15
• 發明（設計）人: 胥傳來;周升陽;匡華;徐麗廣;馬偉;劉麗強;宋珊珊;胡擁明
• 申請（專利權）人: 江南大學;無錫迪騰敏生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K14/795;C07D209/88
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;張仕婷

一種卡拉洛爾人工抗原的合成方法，屬于生物化工技術領域。本發明其由卡拉洛爾與2?氨基?2?甲基丙酸乙酯反應得到具有羧基的產物，即半抗原CLZ，用碳二亞胺法將半抗原CLZ與載體蛋白偶聯，即得到卡拉洛爾人工抗原。本發明成功合成了卡拉洛爾的人工抗原，合成步驟簡潔，有效，完全可用于免疫分析中，為以后人們的研究提供了方便的途徑。

技術領域

本發明涉及一種卡拉洛爾人工抗原的合成方法，屬于生物化工技術領域。

背景技術

卡拉洛爾(carazolol)是一種β-腎上腺素受體阻斷劑，是一類能選擇性與β-腎上腺素受體結合，從而拮抗神經遞質對β-腎上腺素受體激動作用的藥物。因其具有一定的鎮靜作用，在畜牧業養殖中常被非法用于促生長或抗應激，從而導致在動物可食性組織中殘留，對人體健康造成威脅，β-受體阻斷劑類藥物已經成為獸醫臨床上常見的七類獸藥殘留之一。

酶聯免疫法（ELISA）是一種極為高效、敏感、快速的檢測方法，然而得到高親和力和高特異性的單克隆抗體是免疫學檢測的前提，人工抗原的合成是其中重要的一步。

發明內容

本發明的目的是提供一種卡拉洛爾人工抗原的合成方法，所制備的產品用于卡拉洛爾免疫分析方法研究，為今后人們的研究提供了必需的人工抗原。

本發明的技術方案，一種卡拉洛爾人工抗原的合成方法，其由卡拉洛爾與2-氨基-2-甲基丙酸乙酯反應得到具有羧基的產物，即半抗原CLZ，用碳二亞胺法將半抗原CLZ與載體蛋白偶聯，即得到卡拉洛爾人工抗原；步驟為：

（1）半抗原CLZ的合成：

合成路線如下：

將2g，10.9mmol的化合物1溶于20mL異丙醇溶液中滴加NaOH水溶液476mg，11.9mmol，在室溫下攪拌1h；然后一次性加入環氧氯丙烷2.32g，25.1mmol，將溶液在室溫下攪拌過夜；將所得混合物用水稀釋并用乙酸乙酯萃取；將合并的有機層用Na₂SO₄干燥；過濾后，將濾液減壓濃縮，殘余物用硅膠柱純化，得到1.7g化合物2，為白色固體。

將1.7g，7.11mmol化合物2和491mg，3.56mmol K₂CO₃加入到20mL乙腈和5mL水的混合溶液中，然后加入2-氨基-2-甲基丙酸乙酯1.19g，7.11mmol，將混合物在80℃下攪拌過夜；將所得混合物冷卻至室溫并用水稀釋并用乙酸乙酯萃取；將合并的有機層用Na₂SO₄干燥；過濾后，濃縮濾液，用二氧化硅柱純化殘余物，得到1g化合物3，為黃色油狀物。

將1g，2.69mmol化合物3加入10mL四氫呋喃和2mL水的混合物中，然后加入LiOH170mg，4.04mmol，將反應在室溫下攪拌過夜；加入水，水層用乙酸乙酯萃取；將水相用6NHCl水溶液酸化至pH = 7并濃縮至干；通過二氧化硅柱純化粗產物，得到目標化合物200mg，為白色固體半抗原CLZ。

（2）完全抗原的制備：步驟（1）制備的半抗原CLZ，與BSA偶聯得到偶聯物完全抗原CLZ-BSA；或與KLH偶聯得到偶聯物完全抗原CLZ-KLH。

步驟（2）所述完全抗原CLZ-BSA制備方法如下：

a、稱取步驟（1）制備所得半抗原CLZ 8.9 mg，1-乙基碳二亞胺鹽酸鹽15.54 mg，N-羥基琥珀酰亞胺9.8 mg，用500μL無水N,N-二甲基甲酰胺溶解，稱為A液，室溫攪拌反應6-8h；稱取牛血清蛋白BSA 10 mg，其中CLZ與BSA摩爾比為60:1，加入等體積硼酸緩沖溶液，得到B液；在室溫條件下，逐滴將A液加入到B液中，室溫反應過夜，即得偶聯物CLZ-BSA混合液；