[發明專利]一種檢測檳榔細菌性葉斑病菌的方法

在審

• 申請號: 201811294911.4
• 申請日: 2018-11-01
• 公開（公告）號: CN109182589A
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發明（設計）人: 施海濤;韋運謝;劉國銀;方嬌
• 申請（專利權）人: 海南大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 北京精金石知識產權代理有限公司 11470
• 代理人: 強紅剛

本發明公開了一種檢測檳榔細菌性葉斑病菌的方法，該方法包括對被檢樣品進行預處理，提取被檢樣品的DNA；采用特異引物Ba?F/Ba?R進行PCR反應；電泳檢測，判斷結果。本發明的檢測檳榔細菌性葉斑病菌的方法克服了常規檢測方法的不足，具有高特異性、反應穩定的優點，同時準確率高，易操作，用時短，全程檢測只需4?6h。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術檢測細菌領域，尤其涉及一種檢測檳榔細菌性葉斑病菌的方法。

背景技術

檳榔(Areca cathecu L.)，棕櫚科檳榔屬多年生常綠喬木，莖直立，喬木狀，高10多米，最高可達30米，原產于熱帶太平洋地區、東南亞、南亞和東非部分地區，是我國重要的南藥資源之一。中國檳榔主產區在海南和臺灣，其中海南檳榔總產量位居世界第二位，且單位產量同樣位居世界第二，達3336kg/hm²。檳榔是海南第一大經濟作物，海南農民種植檳榔是脫貧致富的途徑之一。

然而，隨著檳榔種植面積的不斷擴大，新的病害也不斷出現。自1985年起，海南島不少檳榔園先后發生不同程度的檳榔細菌性葉斑病，該病害嚴重影響檳榔的生長和產量。檳榔細菌性葉斑病是由須芒草伯克霍爾德氏菌(Burkholderia andropogonis)侵染引起。該病可以侵染各齡檳榔葉，形成褐色壞死病斑，病斑周圍有黃色暈圈，病斑不規則形，嚴重者導致整片葉片黃化干枯。帶病種苗、田間病株及其殘體是該病害的主要侵染來源，其通過雨水、流水和露水傳播，從植株自然孔口和傷口入侵。雨量大、濕度高時，病害發展快，病情重。臺風時雨水傳播病菌，且植株傷口增多，利于病菌入侵，病害易流行。

目前的生產上，迫切需要能在早期診斷該病害的快速檢測技術，但至今尚未見相關報道。因此，建立一套檳榔細菌性葉斑病病原菌快速、穩定的檢測方法，是檳榔產區安全生產的重要保證。

發明內容

鑒于現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種檢測檳榔細菌性葉斑病菌的方法，旨在解決常規檢測方法耗時、準確度偏低的問題。

為了實現本發明的目的，發明人通過大量試驗研究并不懈努力，最終獲得了如下技術方案：

一種檢測檳榔細菌性葉斑病菌的方法，該方法包括：

步驟一、對被檢樣品進行預處理，提取被檢樣品的總DNA；

步驟二、采用特異引物Ba-F/Ba-R進行PCR反應，其中上游引物Ba-F的序列如SEQID NO：1所示，下游引物Ba-R的序列如SEQ ID NO：1所示；

步驟三、電泳檢測，按如下標準判斷檢測結果：有大小為513bp的特異亮帶，表示結果為陽性；若無帶，表示結果為陰性。

進一步優選地，如上所述的檢測檳榔細菌性葉斑病菌的方法，其中的PCR反應體系具體如下：2×TransTaq-T PCR SuperMix 10μl，上下游引物Ba-F和Ba-R各1μl，DNA模板1μl，無菌ddH₂O 7μl，設置陽性對照反應時，用檳榔細菌性葉斑病菌基因組總DNA為模版；設置陰性對照反應時，用無菌ddH₂O代替。

進一步優選地，如上所述的檢測檳榔細菌性葉斑病菌的方法，其中的上游引物Ba-F和下游引物Ba-R濃度均為10μmol/L。

進一步優選地，如上所述的檢測檳榔細菌性葉斑病菌的方法，其中的PCR反應條件具體如下：反應在Biometra 050-901PCR儀上進行，95℃預變性3min；95℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延長40sec，進行40個循環；72℃延長10min。

進一步優選地，如上所述的檢測檳榔細菌性葉斑病菌的方法，其中PCR反應結束后，取5μL反應產物，2％瓊脂糖凝膠電泳后Goldview染色觀察結果。