[發(fā)明專利]具有抗灰葡萄孢菌活性的DHIS的制備方法和應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811294336.8
• 申請日: 2018-11-01
• 公開（公告）號: CN109517848A
• 公開（公告）日: 2019-03-26
• 發(fā)明（設計）人: 于志國;王保娟
• 申請（專利權）人: 沈陽農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12P7/22
• 分類號: C12P7/22;C12N1/20;A01N31/16;A01N25/22;A01P3/00;C12R1/01
• 代理公司: 沈陽科威專利代理有限責任公司 21101
• 代理人: 張述學

本發(fā)明涉及具有抗灰葡萄孢菌活性的DHIS的制備方法和應用，屬于生物來源殺菌劑和農(nóng)藥加工工藝領域，具有抗灰葡萄孢菌活性的DHIS的制備方法，包括制備發(fā)光桿菌發(fā)酵液、DHIS的分離與純化、結構鑒定，并提供了發(fā)光桿菌發(fā)酵液中DHIS含量分析的方法，以及用于防止由灰葡萄孢菌引起的植物灰霉病的應用及使用方法。本發(fā)明優(yōu)化了對發(fā)光桿菌的發(fā)酵條件，大大提高了3,5?二羥基?4?異丙基?二苯乙烯的產(chǎn)量，本發(fā)明制備的DHIS對黃瓜和番茄灰霉病具有優(yōu)異的防治效果，這為開發(fā)抗灰霉病的藥劑奠定了基礎，在配藥劑時添加了抗氧化劑作為保護，有效防止了由于DHIS在空氣中不穩(wěn)定而導致的防效降低。

技術領域

本發(fā)明屬于生物來源殺菌劑和農(nóng)藥加工工藝，具體是涉及一種具有抗灰葡萄孢菌活性的3,5-二羥基-4-異丙基-二苯乙烯(DHIS)的制備方法和應用。

背景技術

灰霉病是由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的一種世界性病害。隨著溫室和大棚中番茄栽培面積的不斷擴大，導致灰霉病成為主要病害之一，每年都會造成大量經(jīng)濟損失，一般為20％～40％，嚴重的達60％。目前，防治灰霉病以化學防治為主，常用的殺菌劑主要有二甲酰亞胺類殺菌劑、苯并咪唑類殺菌劑、苯胺基嘧啶類的嘧霉胺、啶酰菌胺和咯菌腈等。化學農(nóng)藥雖然取得了一定的防治效果，但其帶來的“3R(residue,resistance,resurgence)”問題已經(jīng)引起社會和國內(nèi)外有關專家的高度重視，開發(fā)高效、低毒、對環(huán)境安全的生物農(nóng)藥，已成為農(nóng)藥研發(fā)的主要途徑之一。

3,5-二羥基-4-異丙基-二苯乙烯(簡稱DHIS，見圖1)，該化合物廣泛存在于發(fā)光桿菌的發(fā)酵液中，它被稱為“瑞士軍刀”具有很突出的生物活性，例如可抑制熱帶疾病中的原生生物，可抗真菌和抗革蘭氏陽性菌，殺線蟲，可抑制溶性環(huán)氧化合物水解酶[solubleepoxid hydrolase(sEH)]和在不同的腫瘤細胞系中顯示抗增殖活性，可治療銀屑病，可治療免疫和炎癥等疾病，如專利(申請?zhí)枮椋?201710084890.2)報道了該化合物作為殺螨劑及其治療性應用。目前該化合物的制備路線從酸開始，進行了米迦勒加成、克萊森縮合反應、一鍋法、皂化和脫羧等一系列反應，該方法產(chǎn)量低、分離純化困難。

發(fā)明內(nèi)容

為了彌補上述現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的是提出一種具有抗灰葡萄孢菌活性的3,5-二羥基-4-異丙基-二苯乙烯(DHIS)的制備方法和應用，本發(fā)明優(yōu)化了對發(fā)光桿菌的發(fā)酵條件，大大提高了3,5-二羥基-4-異丙基-二苯乙烯的產(chǎn)量，本發(fā)明制備的3,5-二羥基-4-異丙基-二苯乙烯對黃瓜和番茄灰霉病具有優(yōu)異的防治效果，這為開發(fā)抗灰霉病的藥劑奠定了基礎，在配藥劑時添加了抗氧化劑作為保護，有效防止了由于3,5-二羥基-4-異丙基-二苯乙烯在空氣中不穩(wěn)定而導致的防效降低。

本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的，本發(fā)明提供了具有抗灰葡萄孢菌活性的DHIS的制備方法，其技術要點是：

(1)制備發(fā)光桿菌發(fā)酵液

所述發(fā)光桿菌保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)；保藏地址為湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號武漢大學校內(nèi)；保藏日期為：2018年10月10 日；保藏編號為：CCTCCNO：M2018664，分類命名為：Photorhabdus temperata subsp.cinerea SN35。

所述發(fā)光桿菌經(jīng)NBTA培養(yǎng)基活化，將藍色單菌落接種于液體LB培養(yǎng)基中獲得種子發(fā)酵液，再轉接于改良M發(fā)酵培養(yǎng)基中，放置在180r/min、28℃的恒溫搖床上培養(yǎng)120h得到發(fā)光桿菌發(fā)酵液；

所述改良M培養(yǎng)基的配方為：蛋白胨為15-35g/L，氯化鈉為1-5g/L，葡萄糖6.13g/L，硫酸鎂1.50g/L，硫酸銨2.46g/L，磷酸二氫鉀0.86g/L，磷酸氫二鉀1.11g/L，硫酸鈉1.72g/L，亮氨酸3.00g/L，蒸餾水1L，pH值7.2～7.6；

(2)3,5-二羥基-4-異丙基-二苯乙烯的分離與純化