[發明專利]基于LED陣列編碼照明的三維衍射層析顯微成像方法

有效

• 申請號: 201811292260.5
• 申請日: 2018-11-01
• 公開（公告）號: CN109580457B
• 公開（公告）日: 2021-05-04
• 發明（設計）人: 左超;張巖;陳錢;李加基;孫佳嵩;馮世杰;張玉珍;范瑤;顧瑩
• 申請（專利權）人: 南京理工大學
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14
• 代理公司: 南京理工大學專利中心 32203
• 代理人: 唐代盛

本發明公開了一種基于LED陣列編碼照明的三維衍射層析顯微成像方法，首先采集原始強度圖像，通過移動載物臺或利用電控變焦透鏡采集在不同離焦位置下的三組強度圖像堆棧，然后通采集待測物體在不同離焦位置下的強度圖像堆棧，對任意形狀照明的顯微成像系統的三維相位傳遞函數進行推導，得到在不同相干系數下的圓形和環狀照明下顯微系統的三維相位傳遞函數，并對三維衍射層析定量折射率反卷積重構，對三維散射勢函數進行逆傅里葉變換，將散射勢函數轉換為折射率分布，即可得到被測物體的定量三維折射率分布。本發明實現了對細胞、微小生物組織等樣品高分辨率高信噪比三維衍射層析顯微成像。

技術領域

本發明屬于光學顯微測量、三維折射率成像技術，特別是一種基于LED陣列編碼照明的三維衍射層析顯微成像方法。

背景技術

隨著生物醫學的發展，成像分析測試設備是觀測細胞與生物組織結構形態和生命狀態的重要工具，其中顯微成像儀器作為生物醫學研究中最常用的成像工具越來越重要，而傳統的光學顯微鏡只能獲取待測樣品二維分布圖，并不能給出被測物體的三維空間信息，難以滿足日益發展的生物醫學研究的要求。光學顯微層析成像技術就是一種能實現樣品內部三維結構測量的技術手段。在光學顯微成像技術中，細胞或生物組織的折射率作為待測樣品固有的對比源，包含了重要的信息參數，如細胞或生物組織的形狀，大小，以及體積，這些特征對于生物疾病的形態檢測和醫療診斷至關重要。因此，在生物學研究中，對待測樣品三維折射率的研究對于提高醫學形態檢測與醫療診斷的準確率有著非常重要的意義。

在生物細胞里，不同的折射率分布將引起不同的入射光波相位延遲，根據此原理，相位顯微技術如相稱顯微鏡，微分干涉差顯微鏡和定量相位顯微鏡等得到發展。這些顯微技術將細胞內不同折射率分布轉化為采集到的圖像不同對比度，但是在通常情況下，細胞內的折射率是非常微弱的，這就需要對入射光波進行調制來提高圖像的分辨率。Zernik相位顯微鏡使用一個零頻衰減同時相移90度的相位板進行空間濾波，將物體相位結構轉換成平面上的光強分布(F.Zernike,“Phase contrast,a new method for the microscopicobservation of transparent objects,”Physica 9(7),686–698(1942).；微分干涉差顯微鏡利用渥拉斯頓棱鏡使兩束光產生光程差，從而將待測樣品內部折射率的不同轉化為圖像的明暗變化(G.Nomarski and A.Weill,“Applicationàla métallographie des méthodes interférentielles à deux ondes polarisées,”Rev.Metall 2,121–128(1955))。但是在實際生活中，樣品是三維的，而相位顯微鏡和微分干涉差顯微鏡，這些技術提供的不是定量的相位變化，而且為了得到高分辨率系統一般采用大的數值孔徑，更加導致得到的待測樣品的三維折射率不夠準確；傳統的光學顯微鏡,比如用熒光染料的熒光顯微鏡,被廣大生物醫學研究者廣泛應用。然而，用染料標記的顯微鏡有很多問題，比如染料會改變細胞性質、由于漂白而難以長期測量以及染色過程耗費時間等。為了無需標記即可觀察完整細胞的形態和光學性質，近年來發展的定量相位顯微鏡通過對參考光進行調試，使樣品光束與參考光產生相移，干涉后測量折射率差異。雖然可以獲取成活細胞的三維形態和光學性質，但是相位延遲正比于折射率與路徑長度的乘積，因此只可以提供細胞的平均的折射率參數，而得不到細胞內部詳細三維結構。