[發(fā)明專利]乙型肝炎病毒基因組突變檢測(cè)方法及試劑盒和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811291752.2
• 申請(qǐng)日: 2018-10-31
• 公開（公告）號(hào): CN111118210A
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宮艷萍;才吉卓瑪;林鑫
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳華大因源醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6869;C12Q1/686
• 代理公司: 北京清亦華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11201
• 代理人: 趙天月

1.一種巢氏PCR引物組合物，其特征在于，包括：

第一巢氏PCR引物組，所述第一巢氏PCR引物組包括SEQ ID NO：1-2所示的第一引物對(duì)和SEQ ID NO：3-4所示的第二引物對(duì)；以及

第二巢氏PCR引物組，所述第二巢氏PCR引物組包括SEQ ID NO：5-6所示的第三引物對(duì)和SEQ ID NO：7-8所示的第四引物對(duì)。

2.一種試劑盒，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的巢氏PCR引物組合物，其中，所述第一引物對(duì)、第二引物對(duì)、第三引物對(duì)和第四引物對(duì)均分開放置。

3.一種獲得DNA樣本的HBV基因組序列的方法，其特征在于，包括以下步驟：

利用第一巢氏PCR引物組對(duì)所述DNA樣本進(jìn)行第一巢氏PCR擴(kuò)增，得到第一巢氏PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所述第一巢氏PCR引物組包括SEQ ID NO：1-2所示的第一引物對(duì)和SEQ ID NO：3-4所示的第二引物對(duì)；

利用第二巢氏PCR引物組對(duì)所述DNA樣本進(jìn)行第二巢氏PCR擴(kuò)增，得到第二巢氏PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所述第二巢氏PCR引物組包括SEQ ID NO：5-6所示的第三引物對(duì)和SEQ ID NO：7-8所示的第四引物對(duì)；

將第一巢氏PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和第二巢氏PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合，得到所述待測(cè)DNA樣本的HBV基因組序列。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，

所述第一巢氏PCR擴(kuò)增包括：利用第一引物對(duì)對(duì)所述DNA樣本進(jìn)行第一PCR擴(kuò)增，得到第一PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，然后利用第二引物對(duì)對(duì)所述第一PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行第二PCR擴(kuò)增，得到所述第一巢氏PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

所述第二巢氏PCR擴(kuò)增包括：利用第三引物對(duì)對(duì)所述DNA樣本進(jìn)行第三PCR擴(kuò)增，得到第三PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，然后利用第四引物對(duì)對(duì)第三PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行第四PCR擴(kuò)增，得到第二巢氏PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

5.一種檢測(cè)待測(cè)DNA樣本的HBV基因突變的方法，其特征在于，包括以下步驟：

利用權(quán)利要求3或4所述的方法，獲得所述待測(cè)DNA樣本的HBV基因組序列；

基于所述待測(cè)DNA樣本的HBV基因組序列進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，以便獲得目的DNA文庫(kù)；

將所述目的DNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，以便獲得測(cè)序結(jié)果；

基于所述測(cè)序結(jié)果，確定所述待測(cè)DNA樣本的HBV基因的突變信息。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，將所述待測(cè)DNA樣本的HBV基因組序列依次進(jìn)行DNA片段化、末端修復(fù)和添加堿基“A”、接頭連接和PCR富集，以便實(shí)現(xiàn)所述文庫(kù)構(gòu)建。

7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，將所述測(cè)序結(jié)果與HBV參照基因組進(jìn)行比對(duì)，以便確定所述待測(cè)DNA樣本的HBV基因的突變信息；

任選地，所述突變信息包括SNP位點(diǎn)突變、缺失突變、插入突變或者移碼突變。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述HBV參照基因組選自GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)、EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)或者DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)中至少一種。

9.根據(jù)權(quán)利要求5～8中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，利用Hiseq2500平臺(tái)進(jìn)行所述測(cè)序。

10.根據(jù)權(quán)利要求5～9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括：在所述待測(cè)DNA樣本中選擇取自于表現(xiàn)為HBV耐藥患者的待測(cè)DNA樣本，確定其中的耐藥突變。