[發(fā)明專利]一種酸性多糖中單糖組成的測(cè)定方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811288573.3
• 申請(qǐng)日: 2018-10-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109358154B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 聶少平;石惠方;萬(wàn)宇俊;謝明勇;殷軍藝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南昌大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N30/96
• 分類號(hào): G01N30/96
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• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明提供了一種測(cè)定酸性多糖中單糖組成的方法，檢測(cè)方法步驟包括：(1)通過(guò)弱酸對(duì)多糖進(jìn)行第一步水解，之后配合強(qiáng)酸進(jìn)行第二步水解；(2)通過(guò)離子色譜結(jié)合電化學(xué)檢測(cè)器測(cè)定水解樣品中的單糖組成。所述第一步水解中的弱酸為摩爾濃度較低的三氟乙酸，第二步水解中的強(qiáng)酸為摩爾濃度較高的硫酸。根據(jù)所獲得的離子色譜圖譜，基于峰遷移時(shí)間和峰面積可得到單糖的種類和含量。與傳統(tǒng)的一步水解法相比，本方法精確度高，選擇性好，適用于酸性多糖的單糖組成分析。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及天然產(chǎn)物來(lái)源多糖種的單糖組成分析，具體涉及一種天然產(chǎn)物來(lái)源酸性多糖中單糖組成分析。

背景技術(shù)

多糖是指由超過(guò)10個(gè)的單糖以糖苷鍵連接而成的高分子聚合物，通常存在于動(dòng)物細(xì)胞、高等植物細(xì)胞及部分微生物細(xì)胞壁中，是生命體的重要組成部分，也是維持機(jī)體生命活動(dòng)必不可少的化合物。多糖生物活性與其結(jié)構(gòu)關(guān)系密切，而其單糖組成是結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

在多糖的單糖組成分析過(guò)程中，涉及水解單糖、分離及檢測(cè)等過(guò)程，其中將多糖水解成游離的單糖是非常重要的一個(gè)步驟，目前常用的方法有酸水解、堿水解、酶催化降解及物理降解等。堿催化降解反應(yīng)只能從多糖鏈的還原末端逐個(gè)脫落出單糖，反應(yīng)速率較慢，并且在水解過(guò)程中時(shí)常伴隨著產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的變化，因此目前堿水解技術(shù)尚無(wú)法滿足將多糖水解為單糖的需要。酶催化降解可以選擇性地水解不同的糖苷鍵，并且反應(yīng)速率快，但是酶的高度專一性導(dǎo)致在實(shí)際應(yīng)用中很難找到與底物相契合的酶，酶催化降解對(duì)溫度、pH等環(huán)境有較多要求，因此酶催化降解在多糖水解為單糖的實(shí)際應(yīng)用中有諸多限制。物理降解技術(shù)包括有微波、輻射、超聲波等，但這些物理手段通常很難使多糖完全降解為單糖，通常作為一種輔助手段。

酸水解是指溶液中的氫離子使糖苷鍵上的氧原子質(zhì)子化從而導(dǎo)致糖苷鍵斷裂的過(guò)程，酸水解反應(yīng)可以發(fā)生在多糖鏈的任一糖苷鍵中，具有反應(yīng)速率快、水解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)變化小等優(yōu)點(diǎn)，是多糖水解為單糖的主流技術(shù)。酸水解常用的酸有鹽酸、硫酸、三氟乙酸等，在多糖被水解成為單糖過(guò)程中，往往會(huì)伴隨部分單糖的損失，尤其是中性糖和氨基糖，導(dǎo)致無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定多糖中的單糖組成，對(duì)于酸性多糖中，由于糖醛酸難以被水解，要在盡量減少中性糖的損失的情況下，水解出更多的糖醛酸，從而準(zhǔn)確測(cè)定出酸性多糖中單糖組成。目前，針對(duì)酸性多糖的單糖組成測(cè)定，常用的方法有單種類酸水解，也有人采用綜合的方法優(yōu)化水解效果，如孫元琳等報(bào)道一種當(dāng)歸果膠多糖中的糖醛酸含量測(cè)定方法(中國(guó)食品學(xué)報(bào),2008,8:128-132)，認(rèn)為多糖需經(jīng)脫脂處理并結(jié)合弱酸水解和酶解才能得到準(zhǔn)確、真實(shí)的結(jié)果，De Ruiter等(Analytical biochemistry,1992,207(1):176-185)發(fā)現(xiàn)甲醇解結(jié)合三氟乙酸對(duì)含糖醛酸類多糖的水解效果較好。但是，孫元琳等人報(bào)道的方法需要對(duì)多糖進(jìn)行脫脂特殊處理，同時(shí)要選擇特異性酶的方法處理，步驟較為繁瑣且成本較高；而De Ruiter等所推薦的方法，需要將甲醇溶解在鹽酸中，處理工藝特殊、復(fù)雜。因此，需要對(duì)富含糖醛酸多糖水解進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：為克服傳統(tǒng)水解方法的不足，本發(fā)明提供了一種新的一種酸性多糖單糖中組成的測(cè)定方法，尤其是提高多糖中單糖水解效率。

本發(fā)明具體技術(shù)方案如下：

一種酸性多糖單糖中組成的測(cè)定方法，包括以下步驟：

(1)多糖水解：稱取5mg多糖，加入3mL三氟乙酸溶液加熱進(jìn)行第一步水解，反應(yīng)結(jié)束后再冷卻，之后加入3mL摩爾體積濃度(mol/L)為2的硫酸進(jìn)行第二步水解，于100℃水解時(shí)間2h，水解完成后將樣品溶液轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶定容，取稀釋后的水解樣品溶液并用0.22μm水系微孔濾膜過(guò)濾，取濾液用離子色譜儀分析。

(2)檢測(cè)條件：所述離子色譜儀為DIONEX ICS-5000，柱子采用DIONEX公司的CarboPac^TM PA20分析柱(3mm×150mm)，柱溫箱溫度為30.0℃；檢測(cè)系統(tǒng)為電化學(xué)檢測(cè)器(25.0℃)，流動(dòng)相由摩爾體積濃度(mol/L)為0.25的氫氧化鈉溶液、摩爾體積濃度(mol/L)為1的醋酸鈉溶液和超純水組成，梯度洗脫。