[發明專利]甜菜夜蛾核型多角體病毒的定性定量檢測方法及應用

在審

• 申請號: 201811287910.7
• 申請日: 2018-10-31
• 公開（公告）號: CN109295258A
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發明（設計）人: 陳嬌;陶佩文;尹宜農;林春鴻;楊未;胡家鑫;楊婷;張恒;劉取;賈軍;彭暉
• 申請（專利權）人: 武漢武大綠洲生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;G01N33/569
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 胡建文

1.甜菜夜蛾核型多角體病毒的定性定量檢測方法，其特征在于：包括如下步驟：

1)采用沉降法與差速離心法結合，或沉降法、差速離心法和密度梯度離心法相結合的方法對病毒粒子純化；

2)將純化后的部分病毒粒子采用酶聯免疫法或PCR特異引物法對病毒粒子進行定性鑒別；

3)甜菜夜蛾核型多角體病毒定性確認后，將純化后的剩余病毒粒子制成一定濃度的病毒懸液，采用電子顯微鏡計數法或顯微鏡計數法對病毒粒子的含量進行定量測定。

2.如權利要求1所述的甜菜夜蛾核型多角體病毒的定性定量檢測方法，其特征在于：所述步驟1)中沉降法與差速離心法結合對病毒粒子純化的過程：將感染甜菜夜蛾核型多角體病毒的病死蟲磨碎后加入等量的水，用雙層紗布過濾后收集濾液，將濾液放入離心機在4℃、500～1500r/min條件下離心5～10min，再收集上清液在4℃、4000～8000r/min離心10～40min，收集沉淀，然后加水溶解沉淀，重復離心3～7次，以肉眼看不到雜質為準，即得純化的病毒粒子。

3.如權利要求1所述的甜菜夜蛾核型多角體病毒的定性定量檢測方法，其特征在于：所述步驟1)中沉降法、差速離心法和密度梯度離心法相結合對病毒粒子純化的過程：收集人工感染甜菜夜蛾核型多角體病毒的病死幼蟲，稱重后搗碎，在蟲體中按質量比1：30～1：50加入磷酸鹽緩沖溶液，紗布過濾，濾液經1500～4000r/min差速離心3～7次得到純凈的多角體粗制品，再將多角體病毒粗制品經質量分數為45～70％蔗糖密度梯度離心，取出病毒帶，洗去蔗糖得純凈的多角體，再用質量分數45～70％蔗糖梯度在離心力41000g，溫度4℃條件下超速離心2h，即得純化的病毒粒子。

4.如權利要求1所述的甜菜夜蛾核型多角體病毒的定性定量檢測方法，其特征在于：所述步驟2)中酶聯免疫法對病毒粒子定性鑒別的過程包括如下步驟：

a)抗血清的制備

稱取純化的病毒60mg用無菌生理鹽水配成6mL病毒懸浮液，免疫雄性家兔，選用體重2.5kg的健康雄性家兔，進行靜脈注射5次，劑量分別為2mg/次、4mg/次、8mg/次、16mg/次、25mg/次，每次間隔4d，末次注射一周后，殺兔采血，凝血后采集血清，加疊氮鈉防腐，終濃度為1％，經對流免疫電泳和瓊脂雙擴散試驗鑒定，并測定凝集效價；

b)抗原：病毒標樣稀釋液SeNPV 1.0×10³PIB/mL，1.0×10²PIB/mL，待檢水懸浮液，稀釋成1000倍，10000倍；

c)辣根過氧化物酶標記家兔抗SeNPV的制備

采用飽和硫酸銨沉淀透析法提取IgG，以分光光度計測定IgG含量，并測其凝集效價，然后用辣根過氧化物酶按二步法制備酶標IgG，測定酶和IgG的結合量，算出酶與IgG的克分子比，用瓊脂雙擴散試驗和對流免疫電泳鑒定酶標IgG，在形成單一沉淀線后加酶底物鄰苯二胺進行顯色觀察辣根過氧化物酶的IgG的結合程度；

d)ELISA檢測

先取上述步驟a)制備的特異性抗血清吸附于固相載體，聚苯乙烯微量滴定板作固相載體；然后，取含有抗原的待檢液，與致敏的固相載體溫育后清洗，同時采用步驟b)病毒標樣稀釋液進行對照；再加入步驟c)辣根過氧化物酶標記的特異性抗體，溫育后清洗；最后，加入新配制的鄰苯二胺，室溫下反應30min，滴硫酸溶液50μL，終止反應，出現黃色為陽性，則待檢測樣品為甜菜夜蛾核型多角體病毒。