[發明專利]基于磁性分離的化學發光酶聯免疫檢測DNMT1的方法在審
| 申請號： | 201811286030.8 | 申請日： | 2018-10-31 |
| 公開（公告）號： | CN109406772A | 公開（公告）日： | 2019-03-01 |
| 發明（設計）人： | 吳擁軍;于斐;劉貝貝;玉崧成;何磊良;劉利娥;屈凌波;田詠梅;王佳;王威;王藝琳 | 申請（專利權）人： | 鄭州大學 |
| 主分類號： | G01N33/543 | 分類號： | G01N33/543;G01N33/535;G01N33/541;G01N21/76 |
| 代理公司： | 鄭州德勤知識產權代理有限公司 41128 | 代理人： | 王莉 |
| 地址： | 450001 河南省鄭州*** | 國省代碼： | 河南;41 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 化學發光 化學發光酶聯免疫檢測 磁性分離 預處理 結合聚苯乙烯 抗原抗體反應 單克隆抗體 多克隆抗體 雙抗夾心法 發光檢測 固相載體 回歸方程 免疫磁珠 有機結合 磁分離 靈敏性 酶催化 微孔板 專一性 抗原 磁珠 底液 二抗 構建 加酶 樣本 封閉 檢測 | ||
1.一種基于磁性分離的化學發光酶聯免疫檢測DNMT1的方法，包括以下步驟：
封閉預處理將封閉液加到聚苯乙烯微孔板中依次進行溫育和第一階段洗板處理；
加磁性單克隆抗體向經過第一階段洗板處理的聚苯乙烯微孔板中加入Fe3O4@McAbDNMT1稀釋液并進行磁分離和第二階段洗板處理，使得所述聚苯乙烯微孔板懸浮有第一復合物，所述第一復合物具有Fe3O4@McAbDNMT1結構，且所述Fe3O4@McAbDNMT1為表面被DNMT1小鼠抗人單克隆抗體共價修飾的Fe3O4納米免疫磁珠；
加抗原向懸浮有所述第一復合物的聚苯乙烯微孔板中加入DNMT1標準抗原溶液或待測抗原溶液，并依次進行溫育、磁分離和第三階段洗板處理，使得所述聚苯乙烯微孔板懸浮有第二復合物，該第二復合物具有Fe3O4@McAbDNMT1@AgDNMT1結構；
加多克隆抗體向懸浮有所述第二復合物的聚苯乙烯微孔板中加入兔抗人多克隆抗體PAbDNMT1稀釋液，并依次進行溫育、磁分離和第四階段洗板處理，使得所述聚苯乙烯微孔板懸浮有第三復合物，該第三復合物具有Fe3O4@McAbDNMT1@AgDNMT1@PAbDNMT1結構；
加酶標二抗向懸浮有所述第三復合物的聚苯乙烯微孔板中加入酶標二抗稀釋液，并依次進行溫育、磁分離和第五階段洗板處理，且所述聚苯乙烯微孔板中懸浮有第四復合物，該第四復合物具有Fe3O4@McAbDNMT1@AgDNMT1@PAbDNMT1@酶標二抗結構；
加化學發光底液向懸浮有所述第四復合物的聚苯乙烯微孔板中依次加入發光底液A和過氧化氫溶液進行化學發光處理，形成化學發光溶液，其中，所述發光底液A中包括魯米諾和羥基聯苯；
發光檢測及建立回歸方程利用化學發光檢測儀檢測所述化學發光溶液的發光強度，根據檢測的所述發光強度與所述DNMT1標準抗原溶液或待測抗原溶液濃度之間的關系，建立檢測DNMT1的回歸方程。
2. 根據權利要求1所述的基于磁性分離的化學發光酶聯免疫檢測DNMT1的方法，其特征在于，所述封閉預處理的步驟包括：將濃度為0.5%的BSA/PBS封閉液以每孔250～350 μL加入到所述聚苯乙烯微孔板中，再置于37℃恒溫培養箱中溫育60～120 min，然后再用PBST溶液進行所述第一階段的洗板處理，并拍干。
3. 根據權利要求1或2所述的基于磁性分離的化學發光酶聯免疫檢測DNMT1的方法，其特征在于，所述加入單克隆抗體的步驟包括：用0.008～0.012 mmol/L pH 7～7.5的PBS溶液以1 : 35～45的稀釋比稀釋Fe3O4@McAbDNMT1原液，制得所述Fe3O4@McAbDNMT1稀釋液，并將所述Fe3O4@McAbDNMT1稀釋液以每孔100 μL加入到所述聚苯乙烯微孔板中，然后依次進行磁分離處理和利用PBST溶液進行所述第二階段洗板處理，使得所述聚苯乙烯微孔板中懸浮有所述第一復合物。
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