[發明專利]纖維素內切酶基因及其蛋白和應用

有效

• 申請號: 201811281667.8
• 申請日: 2018-10-23
• 公開（公告）號: CN109182361B
• 公開（公告）日: 2023-07-07
• 發明（設計）人: 胡興;王曉紅;吳賢文;李洪波
• 申請（專利權）人: 懷化學院
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/42;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 重慶嘉品知識產權代理事務所(普通合伙) 50302
• 代理人: 李陽

本發明涉及一種纖維素內切酶基因，所述基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，所編碼的蛋白如SEQ?ID?NO.2所示。本發明還提供了一種可以高效表達且純化該重組蛋白的方法，純化后的蛋白純度高達95％，且具有水解纖維素產生葡萄糖的酶活性，這對于生物燃料乙醇的生產、食品、飼料等行業有重要的工業價值。

技術領域

本發明屬于生物基因工程領域，具體涉及纖維素內切酶基因，還涉及該基因所編碼的蛋白和應用。

背景技術

纖維素是由葡萄糖以β-1，4糖苷鍵構成的多糖，是構成植物細胞壁的重要組分，也是目前地球上含量最豐富的可再生性資源。目前，纖維素的利用率還非常低，如何提高纖維素的利用率仍是一個世界級的課題。纖維素的高效利用離不開降解纖維素相關的酶類。纖維素酶屬于糖苷水解酶類，是專門催化水解纖維素鏈中β-1,4-糖苷鍵的一類酶的總稱，是一種高活性生物催化劑，能夠分解纖維素產生葡萄糖。根據纖維素酶的結構不同，可把纖維素酶分為兩類：纖維素酶復合體和非復合體纖維素酶。纖維素酶復合體是一種超分子結構的多酶蛋白復合體，由多個亞基構成。非復合體纖維素酶由內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶組成。非復合體纖維素酶主要由好氧的絲狀真菌產生，它們是分解纖維素的最重要的酶源。

隨著石油和煤炭資源的日漸枯竭，如何更為有效地轉化和利用纖維素這一自然界分布最廣、最豐富也最廉價的可再生性有機資源和多糖物質，是我國關注的重要研究領域。所以利用纖維素酶降解纖維素，使其轉化成燃料、食物和化學制品，如糖，乙醇，飼料蛋白等，對緩解能源危機，食品和飼料資源緊張有重大的經濟意義，纖維素酶將在食品、飼料、環境保護、能源和資源開發等領域中發揮重要作用。目前雖然發現產纖維素酶的生物群種很多，如細菌、真菌、放線菌及昆蟲、軟體動物等，但是隨著纖維素酶在工、農、畜和醫等領域都有廣泛的需求，其需求量正日益增大，纖維素酶制劑供不應求，前景十分廣闊。而我國的纖維素酶工業制備還處于研究開發階段，纖維素酶的生產還存在纖維素酶活力較低，生產成本較高，生產周期較長等問題使得纖維素酶的應用受到限制，因此，需要克服纖維素酶大量生產的瓶頸。深入研究纖維素酶的作用機制，加強對纖維素酶的分子生物學研究，特別要充分利用DNA基因重組技術的應用，生產具有高酶活的重組蛋白。纖維素酶系包含內切酶、外切酶和糖苷轉移酶3種酶。其中，纖維素內切酶對纖維素的分解起重要作用。目前市售纖維素酶都是各種酶的混合物，很少有利用基因工程手段獲得大最高純度和高活性的纖維素內切酶的相關產品和技術。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種纖維素內切酶基因，以及這種基因所編碼的蛋白，本發明還提供一種構建含有SEQ?ID?NO.1基因序列的重組載體，更提供一種高效表達且純化該重組蛋白的方法。

為達到上述目的，本發明提供如下技術方案：

1.纖維素內切酶編碼基因，所述基因至少含有下列核苷酸序列之一的DNA片段：

1)序列表中SEQ?ID?NO.1的核苷酸序列；

2)與SEQ?ID?NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性、且編碼相同生物學功能蛋白質的核苷酸序列；

3)與SEQ?ID?NO.1所示核苷酸序列雜交且編碼相同生物學功能蛋白質的核苷酸序列。

進一步，與SEQ?ID?NO.1所示核苷酸序列雜交條件為：50℃，在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M?Na3PO4和1mM?EDTA的混合溶液中雜交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；

還可以雜交條件為50℃，在7％SDS、0.5M?Na₃PO₄和1mM?EDTA的混合溶液中雜交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；

還可以雜交條件為50℃，在7％SDS、0.5M?Na₃PO₄和1mM?EDTA的混合溶液中雜交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；