[發明專利]一種外源表達PEPR1蛋白的方法

在審

• 申請號: 201811280271.1
• 申請日: 2018-10-30
• 公開（公告）號: CN109402173A
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發明（設計）人: 湯嬌;孫亞東;韓志富;柴繼杰;石巍
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蜜蜂研究所
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N9/12;C12Q1/34
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種外源表達PEPR1蛋白的方法，其特征在于，包括步驟：

(1)構建含有桿狀病毒來源的抑血細胞聚集素Hemolin信號肽的載體；

(2)克隆得到PEPR1外顯子基因，將PEPR1外顯子基因連入步驟(1)的載體上，得到外源表達載體；

(3)外源表達載體轉染昆蟲細胞，獲得重組桿狀病毒，病毒侵染昆蟲細胞，培養該昆蟲細胞后，收獲細胞和上清，上清液經層析，純化后獲得構象正確的PEPR1蛋白。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述載體的構建方法是在pFastBac^TM1的BamH1酶切位點前加入Hemolin信號肽得到pFastBac^TMHem載體；所述Hemolin信號肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，PEPR1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.根據權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，步驟(2)的PEPR1外顯子基因連入載體前采用BamH1和Sal1酶切PEPR1外顯子基因。

5.根據權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，采用BamH1和Xho1酶切步驟(1)構建得到的載體，酶切后與PEPR1外顯子基因連接，構建外源表達載體。

6.根據權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，獲得重組桿狀病毒后，對昆蟲細胞采用Expression System ESF AF培養基擴大培養，再用獲得的重組桿狀病毒侵染擴大培養后的昆蟲細胞，純化獲得正確構象的PEPR1蛋白。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，采用義翹神州公司的Expression System ESF AF培養基將昆蟲細胞稀釋至細胞濃度為0.3×10⁶-1×10⁶個/mL，過夜培養，當生長到1.6×10⁶-2.0×10⁶個/mL時，加入含PEPR1的重組桿狀病毒，培養后收集細胞培養液上清。

8.權利要求1-7任一所述的方法制備得到的PEPR1蛋白。

9.一種表達PEPR1蛋白的外源表達載體，其特征在于，該載體上與目的基因N端連接的前端加入一段桿狀病毒來源的抑血細胞聚集素Hemolin信號肽；載體優選為pFastBac^TMHem，是在載體pFastBac^TM1的BamH1酶切位點前加入Hemolin信號肽得到，所述Hemolin信號肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

10.權利要求1-7任一所述的方法或權利要求8所述的PEPR1蛋白或權利要求9所述的外源表達載體在篩選可以激活植物免疫反應的小分子藥物或研制植物抗菌藥或提高植物抗病表型或提高植物產量中的應用。