[發(fā)明專利]一種醇脫氫酶突變體及其在輔酶再生中的應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811277370.4
• 申請日: 2018-10-30
• 公開（公告）號: CN109402076A
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 倪曄;朱誠;許國超;周婕妤
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/22;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發(fā)明公開了一種醇脫氫酶突變體及其在輔酶再生中的應(yīng)用，屬于酶工程以及生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的醇脫氫酶突變體是通過將出發(fā)氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的醇脫氫酶的第84位纈氨酸和/或第127位酪氨酸進(jìn)行突變得到的；此醇脫氫酶突變體對多種醇類輔底物(如1,4?丁二醇、1,5?戊二醇、1,6?己二醇)均具有較高的活力，可以催化這些醇類輔底物進(jìn)行輔酶NADPH再生；且與野生型醇脫氫酶KpADH相比，其活性、催化效率更高，對輔底物1,4?丁二醇的k_cat值最高可達(dá)75.9min^?1，是野生型KpADH的7.3倍，k_cat/K_m值可達(dá)2009min^–1·M^–1，是野生型KpADH的14.7倍，K_m值最低可為11.3mM，較野生型醇脫氫酶KpADH有了顯著的降低，因此，本發(fā)明的醇脫氫酶突變體具有更高的工業(yè)應(yīng)用價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明提供了一種醇脫氫酶突變體及其在輔酶再生中的應(yīng)用，屬于酶工程以及生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

依賴輔酶NAD(P)H的生物不對稱還原反應(yīng)具有選擇性高、條件溫和、環(huán)境友好等眾多優(yōu)點(diǎn)，是最具應(yīng)用開發(fā)潛力的手性化合物制備方法。但是，其所使用的輔酶NAD(P)H價格十分昂貴，為了生物不對稱還原反應(yīng)的可持續(xù)性和高效性，也為了降低生物不對稱還原反應(yīng)的成本，需要進(jìn)行輔酶再生。

現(xiàn)在，已經(jīng)有的輔酶再生方法有酶法再生、電化學(xué)法再生和光化學(xué)法再生等，其中，酶法再生因?yàn)榉磻?yīng)速度快、選擇性高、再生體系與合成體系兼容性好及過程容易控制等優(yōu)點(diǎn)，具有較大的工業(yè)應(yīng)用潛力。

而酶法輔酶再生中，異丙醇和乙醇具有良好的氧化還原潛力(ΔG’-7.4kcal·mol^–1)且價格低廉，因此，利用醇脫氫酶(ADH)催化氧化異丙醇和乙醇進(jìn)行輔酶再生的方法具有價格低廉、原子利用率高等優(yōu)點(diǎn)。

但是，此方法中，乙醇被醇脫氫酶催化氧化生成的輔產(chǎn)物乙醛具有毒性，進(jìn)一步催化氧化生成的醋酸會降低反應(yīng)體系的pH值，不利于反應(yīng)的進(jìn)行；異丙醇被醇脫氫酶催化氧化生成的輔產(chǎn)物丙酮則不穩(wěn)定且具有毒性，且由于異丙醇被醇脫氫酶催化氧化生成丙酮的過程是可逆反應(yīng)，使得利用醇脫氫酶(ADH)催化氧化異丙醇進(jìn)行輔酶再生的過程通常需要加入過量的異丙醇才能維持整個反應(yīng)過程朝向目標(biāo)產(chǎn)物合成的方向進(jìn)行。因此，急需找到一種新的輔酶再生方法以克服上述技術(shù)的缺陷。

目前，已經(jīng)有部分針對新型輔酶再生方法的研究取得了一定的進(jìn)展。例如，2008年，Lavandera I和Kroutil W等利用以Sphingobium yanoikuyae來源的醇脫氫酶SyADH催化帶有吸電子基團(tuán)(如氯、氟、甲氧基等)丙酮的仲醇氧化進(jìn)行輔酶再生。由于這類輔底物帶有吸電子基團(tuán)，可與輔產(chǎn)物中的羥基形成氫鍵作用而將輔產(chǎn)物穩(wěn)定(ΔG’-11.1kcal/mol)，使得反應(yīng)趨于不可逆，稱為準(zhǔn)不可逆反應(yīng)(Quasi-irreversible reaction)，因此，利用該體系，在僅1.5倍底物當(dāng)量1-氯丙酮協(xié)助下，反應(yīng)24h可將30g/L 2-辛醇完全氧化(Lavandera I.,et al.,Org Lett.,2018,10,2155-2158)。

Hollmann等人則發(fā)現(xiàn)：1,4-丁二醇可作為智能輔底物，在醇脫氫酶的作用下催化氧化過程中先被還原生成4-羥基丁醛，再自發(fā)轉(zhuǎn)化為2-羥基四氫呋喃，最后進(jìn)一步不可逆地被還原生成最終輔產(chǎn)物γ-丁內(nèi)酯(GBL)，整個過程的ΔG’為-8.2kcal·mol^–1，并釋放出兩分子的輔酶NADH，因此，1,4-丁二醇可以作為一種智能輔底物(smart cosubstrate)用于輔酶再生，且后期在針對此過程的進(jìn)一步研究中還發(fā)現(xiàn)，此過程產(chǎn)生的輔產(chǎn)物γ-丁內(nèi)酯具有動力學(xué)和熱力學(xué)穩(wěn)定的特點(diǎn)，能夠改變Meerwein-Ponndorf-Verley反應(yīng)的化學(xué)平衡從而減少輔底物的過量添加(Kara S.,et al.,Green Chem.2013,15,330-335)。