[發明專利]一種氧化石墨烯納米復合材料固定的微生物復合制劑、制備方法及其在焦化廢水中的應用

有效

• 申請號: 201811277203.X
• 申請日: 2018-10-30
• 公開（公告）號: CN109536400B
• 公開（公告）日: 2021-12-31
• 發明（設計）人: 李勇;龐聰樂;梁文婷;董川
• 申請（專利權）人: 山西大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N11/14;C02F3/34;C12R1/38;C12R1/01
• 代理公司: 太原市科瑞達專利代理有限公司 14101
• 代理人: 趙禛

1.一種氧化石墨烯納米復合材料固定的微生物復合制劑，其特征在于：微生物復合制劑包括弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacterfreundi）和惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida），所述弗氏檸檬酸桿菌由中國工業微生物菌種保藏管理中心保藏，弗氏檸檬酸桿菌的保藏編號為：CGMCC No. 1.173；所述惡臭假單胞菌由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，惡臭假單胞菌的保藏編號為：CICC 21906。

2.一種如權利要求1所述的氧化石墨烯納米復合材料固定的微生物復合制劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

S1、制備液體發酵培養基：稱取原料：3.0g~5.0g牛肉膏，10.0g蛋白胨，5.0g~10.0g氯化鈉、0.03gMnSO₄·H₂0、0.7g氯化鉀、1.0gNH₄NO₃，將稱取的原料溶解于1000mL蒸餾水中，調節混合溶液的pH值為7.0~7.2，121℃環境中以205.8kPa壓力滅菌30min；

制備固體斜面和平板培養基：稱取原料：3.0g~5.0g牛肉膏，10.0g蛋白胨，5.0g~10.0g氯化鈉、17.0g~18.0g瓊脂，將稱取的原料溶解于1000mL蒸餾水中，調節混合溶液的pH值為7.0~7.2，121℃環境中以205.8kPa壓力滅菌30min；

S2、制備濕菌體：首先，將保存于-20℃的弗氏檸檬酸桿菌和惡臭假單胞菌菌株分別取出，在超凈工作臺上于凝固備用的固體斜面培養基中劃線，30℃恒溫培養48h；然后，待培養基中長出單菌落，再將活化的菌株挑取白色單菌落轉進10mL液體培養基中，30℃恒溫環境中以170r/min搖床培養18h；最后，將活化后的弗氏檸檬酸桿菌和惡臭假單胞菌培養液分裝在已滅菌的離心管中，放入離心機中在4℃環境中離心40min，離心機轉速為4000r/min，離心后將上清液倒掉，倒置離心管10min，即可獲取檸檬桿菌和惡臭假單胞菌濕菌體，用無菌水將菌體重懸至0.1g/mL；

S3、制備氧化石墨烯納米復合材料載體：

①、氧化石墨烯的合成：首先，稱取1.0g石墨粉和0.5g 硝酸鈉加入到23mL濃度為98%的濃硫酸中，冰浴冷卻到0℃~5℃，強烈攪拌混合液的同時將3.0g 高錳酸鉀緩慢加入混合液中，控制混合液溫度不超過20℃，反應2h；其次，將混合液從冰浴環境中取出后移入水溫為35℃的恒溫水浴鍋中隔水保溫12h，然后在混合液中緩慢加入46mL二次蒸餾水，將混合液移到80℃~98℃的恒溫油浴鍋中保溫15min~40min；再次，將混合液用二次蒸餾水稀釋到140mL，加入2.5mL濃度為30%的雙氧水，將混合液攪拌后過濾，并用二次蒸餾水洗滌3次；最后，將洗凈的混合物在70℃環境中真空干燥12h；

②氧化石墨烯水溶液的制備：在蒸餾水中加入10mg氧化石墨粉末，配制成一系列濃度為0.05%wt.~ 0.3%wt.的氧化石墨烯水溶液，超聲分散60 min，離心去除水溶液中的大顆粒后備用；

S4、制備固定化微生物復合制劑：

①、向容積為50mL的兩口燒瓶中加入20 mL步驟S3配置好的氧化石墨烯溶液，然后向氧化石墨烯溶液中加入0.5%wt.明膠、0.42%~0.84%wt.丙烯酸，于100℃恒溫水浴鍋中攪拌3小時使其充分溶解混合，121℃環境中以205.8kPa壓力滅菌30min；

②、待溶液在無菌條件下冷卻后，加入步驟S2中獲得的弗氏檸檬酸桿菌菌液1mL和惡臭假單胞菌菌液1mL，充分混合均勻后，加入過硫酸銨20mg、已二酸雙酯2~3mg，攪拌后在氮氣保護氣氛圍中培養30min，再加入N，N，N'，N'-四甲基二乙胺20μL，混合均勻后將溶液快速倒入模具中，室溫交聯反應12h；

③、取出交聯后的小球，用生理鹽水沖洗3次后，即得氧化石墨烯納米復合材料固定的微生物復合制劑，收集備用。

3.根據權利要求2所述的一種氧化石墨烯納米復合材料固定的微生物復合制劑的制備方法，其特征在于：所述步驟S2中，無菌水中菌體的數量為6.33×10⁹~1.9×10¹⁰個/mL。