[發明專利]一種高產γ-氨基丁酸的乳酸菌誘變方法及篩選方法

在審

• 申請號: 201811277124.9
• 申請日: 2018-10-30
• 公開（公告）號: CN109182226A
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發明（設計）人: 李文;王陶;李同祥
• 申請（專利權）人: 徐州工程學院
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/01;C12P13/00;C12R1/01
• 代理公司: 徐州市淮海專利事務所 32205
• 代理人: 李妮

1.一種高產γ-氨基丁酸的乳酸菌誘變方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)發酵液的制備：選取實驗室保存的乳酸片球菌ZY-6(Weissella viridescens ZY-6)作為出發菌株，該菌株已于2018年5月28日保存在中國廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為GDMCC NO：60377，將該菌株接種到馬鈴薯或馬丁氏液體培養基中活化培養2d-6d，得到發酵液；

(2)菌懸液制備：取上述發酵液10mL于三角瓶中，并加入50顆玻璃珠，震蕩10min-20min，然后用無菌水按照1:10，1:100，1:1000比例，稀釋成不同濃度，制得菌懸液；

(3)誘變處理：

①紫外誘變處理：不同濃度的菌懸液在紅光燈下各吸5ml于9cm雙碟中，放入攪拌子，于15W、距離照射菌懸液30cm的紫外燈下，分別照射0s、15s、30s、45s、60s、75s、90s，制定致死率曲線，選擇致死率在70％-90％的時間誘變，制得處理液；

②處理液的分離：吸0.5ml的處理液于第1號稀釋管中，得10^-1稀釋菌液，如此重復6次，依次稀釋到10^-6稀釋菌液；

③紫外-氯化鋰復合處理：將稀釋到10^-6稀釋菌液重復上述紫外誘變處理進行二次誘變，將二次誘變后的菌液涂布在含0.2％-0.3％的氯化鋰培養基上；

(4)培養：所有涂布完成的培養基放入培養箱中在35℃-40℃條件下培養36h-72h。

2.根據權利要求1所述的高產γ-氨基丁酸的乳酸菌的誘變方法，其特征在于，步驟(3)中進行紫外照射前紫外燈先預熱15-20min。

3.根據權利要求1或2所述的高產γ-氨基丁酸的乳酸菌的誘變方法，其特征在于，所述馬鈴薯液體培養基的組成為：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂15～20g和水1000mL；馬丁氏液體培養基的組成為：磷酸二氫鉀1g、硫酸鎂0.5g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、瓊脂15～20g和水1000ml。

4.根據權利要求1或2所述的高產γ-氨基丁酸的乳酸菌的誘變方法，其特征在于，所述氯化鋰培養基的組成為：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂15～20g、水1000mL和0.2g～0.3氯化鋰；或者是磷酸二氫鉀1g、硫酸鎂0.5g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、瓊脂15～20g、水1000ml和0.2g～0.3氯化鋰。

5.一種高產γ-氨基丁酸的乳酸菌的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)供試乳酸菌發酵培養：將權利要求1或2所述的方法誘變后的供試乳酸菌菌種接種于MRS培養基中，在41℃靜置厭氧培養24h，以3％的接種量接種到含有1％L-谷氨酸鈉的GYP發酵培養基中，靜置厭氧培養48h，取發酵液進行離心，轉速2000r/min、離心時間10min，取上清液；

(2)γ-氨基丁酸產生菌初步篩選：吸取上清液2μL，點樣于G型薄層硅膠板上，點樣線距底邊2cm，點樣點間距1.5cm，以展開劑系統：正丁醇：乙酸：水＝5：3：2，采用4g/L茚三酮作為顯色劑，當層析到達硅膠板上端1-2cm時結束層析，在65℃條件下烘干濾紙，以是否存在γ-氨基丁酸對應的斑點作為檢測指標，同時以1％的γ-氨基丁酸和L-谷氨酸鈉標準樣品做為對照檢測，篩選出能夠合成γ-氨基丁酸的乳酸菌；

(3)高產γ-氨基丁酸乳酸菌的復篩：將初篩出的乳酸菌菌株接種到含有150mL無菌種子培養基的三角瓶中，41℃靜置培養24h后，以5％的接種量接入含有150mL無菌發酵培養基的三角瓶中，每瓶種子接三瓶發酵液進行對照，41℃靜置培養24h，采用液相色譜法測定發酵液中GABA的含量，挑選出γ-氨基丁酸產量較高的菌株。

6.根據權利要求5所述的高產γ-氨基丁酸的乳酸菌的篩選方法，其特征在于，所述無菌種子培養基的組成為：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g、瓊脂1.5g和純化水1000ml。