[發(fā)明專利]一種人類斑禿相關(guān)基因突變篩查的組合引物及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811276284.1
• 申請(qǐng)日: 2018-10-30
• 公開（公告）號(hào): CN109295211A
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 毛燕;鄭彥麗;操立超;鄶斌;李潔璇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳市萬眾基因轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12Q1/6883
• 分類號(hào): C12Q1/6883;C12N15/11
• 代理公司: 合肥中博知信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 34142
• 代理人: 李德勝

1.一種人類斑禿相關(guān)基因突變篩查的組合引物，其特征在于：所述組合引物包括針對(duì)人類斑禿在chr1、chr2、chr3、chr4、chr5、chr6、chr9、chr10、chr11、chr12、chr14、chr16、chr18、chr19染色體上的ACOXL基因上的rs12986962和rs3789129位點(diǎn)，CLEC16A基因上的rs3862469位點(diǎn)，F(xiàn)AM19A2基因上的rs4348998位點(diǎn)，F(xiàn)PR2基因上的rs17834679位點(diǎn)，GSE1基因上的rs7500151位點(diǎn)，IL13基因上的rs848位點(diǎn)，IRF4基因上的rs6906608位點(diǎn)，LOC101928337基因上的rs12348691位點(diǎn)，LPP基因上的rs9864529位點(diǎn)，MAGI3基因上的rs17031716位點(diǎn)，PFKFB3基因上的rs631902位點(diǎn)，PLXNC1基因上的rs7299099位點(diǎn)，RP11基因上的rs2847266位點(diǎn)，SYT14基因上的rs170557位點(diǎn)，TNFRSF1A基因上的rs1860545位點(diǎn)以及基因間的rs10761660、rs1171582、rs2216164、rs247459、rs2781388、rs574087、rs6848139、rs7682481、rs9275524、rs972099位點(diǎn)；所述組合引物包含了所有所選位點(diǎn)的正向引物和反向引物，如chr2染色體上rs12986962位點(diǎn)的引物包含了正向引物序列SEQ IDNO:1和反向引物序列SEQ ID NO:2，其它位點(diǎn)的引物序列詳見引物序列表。

2.權(quán)利要求1所述的組合引物在制備人類斑禿相關(guān)基因突變篩查試劑盒中的應(yīng)用。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括權(quán)利要求1所述的組合引物和一組包含飽和染料的PCR反應(yīng)mix，所述組合引物的序列如SEQ ID NO:1-52所示。

4.權(quán)利要求3所述的試劑盒在人類斑禿相關(guān)基因突變篩查中的應(yīng)用。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟：

1)樣品采集、DNA提取和PCR擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)：所述擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)為上述組合引物；

2)高分辨率溶解熒光定量PCR擴(kuò)增上述組合引物：將步驟1)中不同的組合引物按照等比例混合，混合后作為一個(gè)的引物池，按照試劑盒要求配置反應(yīng)體系，體系如下：

用此引物按照熒光定量PCR的方法進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下：95℃預(yù)變性10min；然后按95℃變性10s，65-55℃退火10s，每個(gè)循環(huán)下降0.5℃，72℃延伸30s的程序進(jìn)行45個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增出的DNA片段即為擴(kuò)增文庫；

3)步驟2)中的DNA片段按照高分辨率熔解曲線法進(jìn)行高分辨率溶解曲線過程，擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解步驟在PCR循環(huán)結(jié)束后立即進(jìn)行，程序?yàn)椋荷郎刂?5℃1min，然后降溫至40℃1min，再升溫至65℃1s，從65℃連續(xù)升溫到95℃的過程中進(jìn)行熒光收集，25次/℃，最后，降溫至40℃。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于：所述組合引物為26對(duì)組合引物，所述上游組合引物與下游組合引物之間的退火溫度3度內(nèi)，且引物對(duì)與引物對(duì)之間形成的引物二聚體的△G的絕對(duì)值小于5。