[發(fā)明專利]一種產(chǎn)β-羥基-β-甲基丁酸工程菌的構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811273509.8
• 申請(qǐng)日: 2018-10-30
• 公開（公告）號(hào): CN109251940B
• 公開（公告）日: 2020-10-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 范文超;高書良;王金剛;梁巖;袁圣倫;任亮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江華睿生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/90
• 分類號(hào): C12N15/90;C12N9/22;C12N1/19;C12P7/42;C12R1/645
• 代理公司: 上海申浩律師事務(wù)所 31280
• 代理人: 賈師英

本發(fā)明公開了一種產(chǎn)β?羥基?β?甲基丁酸工程菌的構(gòu)建方法，包括下述步驟：以解脂耶氏酵母為底盤細(xì)胞，對(duì)其基因組中參與脂肪酸降解代謝的pox2、pox3、hbd、hcd和faa1共5個(gè)基因進(jìn)行中斷失活處理，得到基因剪切菌株；將黏細(xì)菌來(lái)源的LiuC、AibA和AibB基因、以及大腸桿菌來(lái)源的TesB基因整合入所述基因剪切菌株的基因組，得到產(chǎn)β?羥基?β?甲基丁酸的工程菌。本發(fā)明構(gòu)建的工程菌能夠以葡萄糖為碳源發(fā)酵合成目標(biāo)產(chǎn)物HMB，產(chǎn)量最高可達(dá)10g/L。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種產(chǎn)β-羥基-β-甲基丁酸工程菌的構(gòu)建方法，具體涉及一種用于生產(chǎn)β-羥基-β-甲基丁酸的解脂耶氏酵母菌的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

β-羥基-β-甲基丁酸(3-Hydroxy-3-methylbutyrate Hydrate，HMB)是無(wú)色晶體，分子式為C₅H₁₀O₃，結(jié)構(gòu)式為：

HMB的鈣鹽是一種營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑，可以在運(yùn)動(dòng)員耐力訓(xùn)練中防止肌肉損傷、肌蛋白斷裂，也可作為減肥食品的有效成分；可促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、減少脂肪、增加瘦肉，保證動(dòng)物健康。該化合物在1995年通過(guò)美國(guó)GRAS認(rèn)證，推薦使用量≤3g/天，市場(chǎng)潛力巨大。

在人和動(dòng)物體內(nèi)的天然代謝途徑中，β-羥基-β-甲基丁酸可經(jīng)由支鏈氨基酸代謝途徑中的亮氨酸(leucine)降解的中間產(chǎn)物α-KIC(α-ketosiocaproate)生成(Miyazaki,T.,A.Honda,T.Ikegami,J.Iwamoto,T.Monma,T.Hirayama,Y.Saito,K.Yamashita andY.Matsuzaki.Simultaneous quantification of salivary 3-hydroxybutyrate,3-hydroxyisobutyrate,3-hydroxy-3-methylbutyrate,and 2-hydroxybutyrate aspossible markers of amino acid and fatty acid catabolic pathways by LC–ESI–MS/MS.SpringerPlus.2015,4(1):494.)。目前HMB主要依賴化學(xué)合成法進(jìn)行制備，例如主要是以次氯酸鈉、二丙酮醇、鹽酸、乙酸乙酯、乙醇、氫氧化鈣為反應(yīng)原料，經(jīng)過(guò)氧化合成、酸化、萃取、中和反應(yīng)、離心、干燥等步驟制得。但是，化學(xué)合成法存在著有機(jī)溶劑、腐蝕性酸等試劑使用量大、廢料污染嚴(yán)重等無(wú)法克服的缺陷，使得化學(xué)合成法受到環(huán)境保護(hù)政策的嚴(yán)重管控和限制，承受著巨大的環(huán)保壓力。

目前，人們普遍認(rèn)為天然或生物來(lái)源的化合物更安全，對(duì)于藥品、食品、化妝品成分的來(lái)源越來(lái)越追求“天然化”。出于市場(chǎng)推廣目的，藥品、食品、化妝品生產(chǎn)商都更樂(lè)意使用生物來(lái)源的產(chǎn)品來(lái)替代化學(xué)方法合成出來(lái)的相同物質(zhì)。HMB作為廣泛使用的天然化合物，尋找一種綠色環(huán)保的生物方法替代化學(xué)方法來(lái)生產(chǎn)已成為一種研究熱點(diǎn)。

近些年來(lái)，生物合成法日益受到業(yè)內(nèi)青睞。目前研究的HMB生物法主要是利用Galactomyces reessii菌體細(xì)胞發(fā)酵、同步流加底物β-甲基丁酸進(jìn)行生物催化來(lái)制備HMB(Lee,I.Y.and J.P.N.Rosazza.Archives of Microbiology.1998,169(3):257-262.Lee,I.Y.,S.L.Nissen and J.P.Rosazza.Applied and Environmental Microbiology.1997,63(11):4191-4195.)。但是，該方法存在反應(yīng)產(chǎn)物組分復(fù)雜、后期分離純化困難等問(wèn)題。

目前還未有直接通過(guò)天然真菌或真菌工程菌進(jìn)行發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)HMB的報(bào)道，這成為本發(fā)明要實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容