[發(fā)明專利]胱抑素C膠乳增強比濁法檢測試劑盒及其制備使用方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811257253.1
• 申請日: 2018-10-26
• 公開（公告）號: CN109406771B
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 芮雙印;符修樂
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽大千生物工程有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/531;C12N15/70;C12N15/13
• 代理公司: 合肥興東知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 34148
• 代理人: 王偉

1.一種胱抑素C膠乳增強比濁法檢測試劑盒，其特征在于，包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應(yīng)含量為：

試劑R1：

緩沖液??10～100mM/L

穩(wěn)定劑??5～50g/L

防腐劑??0.1～1g/L

其溶劑為純化水；

試劑R2：

其溶劑為純化水；

其中，所述交聯(lián)重組抗人Cys-C單鏈抗體的膠乳微球和交聯(lián)山羊抗人Cys-C多克隆抗體的膠乳微球的獲取方法如下：

(1)先通過設(shè)計胱抑素C特異性引物，從人全血中提取基因組DNA，進行PCR反應(yīng)；再將擴增出的胱抑素C基因連接到克隆載體pMD-18T載體中，并導入到DH5α克隆菌中進行復制；接著，再提取質(zhì)粒進行雙酶切，并將酶切產(chǎn)物連接到表達載體pET-32a中；最后，將其導入到表達菌BL-21中進行發(fā)酵表達；其中，設(shè)計的胱抑素C特異性引物的上游引物序列如SEQ?IDNO.1所示，下游引物序列如SEQ?ID?NO.2所示，擴增出的胱抑素C基因序列如SEQ?ID?NO.3所示；

(2)對表達產(chǎn)物進行純化和鑒定；

(3)利用純化產(chǎn)物分別免疫BALB/c小鼠和山羊；

BALB/c小鼠免疫達到指定抗體水平后，取脾臟，制備雜交瘤細胞，篩選抗胱抑素C陽性的細胞株，擴大培養(yǎng)后，收獲陽性細胞；提取陽性細胞的總RNA，使用小鼠Ig簡并引物擴增出小鼠Ig輕重鏈可變區(qū)；測序獲得該胱抑素C單克隆抗體的基因序列，針對該VH和VL設(shè)計OverLap?PCR引物，并使用上述提取的陽性細胞的總RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板擴增出VH-VL的融合基因片段；將該融合基因片段連接到克隆載體pMD-18T載體中，導入到DH5α克隆菌中進行復制，提取質(zhì)粒進行雙酶切，并將酶切產(chǎn)物連接到表達載體pET-32a中，并導入到表達菌BL-21中進行發(fā)酵表達；最后，將該表達產(chǎn)物進行純化、鑒定后備用；其中，小鼠抗人Cys-C蛋白輕鏈可變區(qū)基因序列如SEQ?ID?NO.4所示；小鼠抗人Cys-C蛋白重鏈可變區(qū)基因序列如SEQ?ID?NO.5所示；輕鏈的上游引物序列如SEQ?ID?NO.6所示，輕鏈的下游引物序列如SEQ?ID?NO.7所示；重鏈的上游引物序列如SEQ?ID?NO.8所示，重鏈的下游引物序列如SEQID?NO.9所示；其中，輕鏈的上游引物帶有Nco?I酶切位點，重鏈的下游引物帶有EcoR?V酶切位點；輕鏈的上游引物和重鏈的下游引物還均帶有腸激酶酶切位點，且該序列經(jīng)大腸桿菌偏好密碼子優(yōu)化，輕鏈的下游引物和重鏈的上游引物均含有柔性linker，linker序列如SEQID?NO.10所示；

山羊免疫達到指定抗體水平后，無菌采血，制備抗血清，將抗血清純化后獲得免疫球蛋白，鑒定后備用；

(4)將上述所得兩種抗體分別交聯(lián)至直徑80～130nm聚苯乙烯膠乳微球，分別得到交聯(lián)重組抗人Cys-C單鏈抗體的膠乳微球和交聯(lián)山羊抗人Cys-C多克隆抗體的膠乳微球。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胱抑素C膠乳增強比濁法檢測試劑盒，其特征在于，所述緩沖液具體為Tris-HCL緩沖液、PBS緩沖液、PB緩沖液和HEPES緩沖液中的一種或多種。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胱抑素C膠乳增強比濁法檢測試劑盒，其特征在于，所述表面活性劑具體為曲拉通-100、曲拉通-114、吐溫-20和吐溫-80中的一種或多種。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胱抑素C膠乳增強比濁法檢測試劑盒，其特征在于，所述穩(wěn)定劑具體為PEG6000、PEG8000、DTT、BSA和EDTA中的一種或多種。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胱抑素C膠乳增強比濁法檢測試劑盒，其特征在于，所述防腐劑具體為硫柳汞鈉、疊氮鈉和硫酸慶大霉素中的一種或多種。