[發明專利]一種提高胎兒血紅蛋白表達水平的方法

有效

• 申請號: 201811256120.2
• 申請日: 2018-10-26
• 公開（公告）號: CN109735497B
• 公開（公告）日: 2021-11-02
• 發明（設計）人: 袁鵬飛;方日國;于玲玲;夏鵬輝;王佳;梁福才
• 申請（專利權）人: 博雅輯因（北京）生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/113;C12N15/90;C12N5/078;A61K35/18;A61K35/14;A61P7/06;A61P35/00
• 代理公司: 北京彩和律師事務所 11688
• 代理人: 閆桑田;劉磊

1.一種體外提高人造血干細胞胎兒血紅蛋白(HbF)表達的方法，包括：

通過基因編輯技術破壞所述造血干細胞中2號染色體第60495219位至第60495336位的BCL11A基因組區域，其中所述基因編輯技術為CRISPR/Cas9基因編輯技術，其中，所述BCL11A基因組靶核苷酸序列與SEQ ID NO:4序列互補。

2.權利要求1的方法，將包含SEQ ID NO:4序列的sgRNA導入所述造血干細胞以實現對所述BCL11A基因組的編輯。

3.權利要求2的方法，其中所述sgRNA是經過2’-O-甲基類似物和/或核苷酸間3’硫代修飾的。

4.權利要求3的方法，其中所述化學修飾為所述sgRNA的5’端前一個、二個和/或三個堿基和/或3’端的最后一個堿基的2’-O-甲基類似物修飾。

5.權利要求1-4任一項的方法，其中將所述sgRNA與Cas9編碼核苷酸共同導入所述造血干細胞。

6.權利要求5的方法，其中通過電轉方法將sgRNA與Cas9編碼核苷酸共同導入所述造血干細胞。

7.權利要求6的方法，其中所述電轉條件為200-600V，0.5ms-2ms。

8.一種通過CRISPR/Cas9系統體外高效編輯造血干細胞的方法，包括將含有SEQ IDNO:4序列的sgRNA導入造血干細胞，其中該sgRNA是經過2’-O-甲基類似物和/或核苷酸間3’硫代修飾的。

9.權利要求8的方法，其中將所述sgRNA與Cas9編碼核苷酸共同導入所述造血干細胞。

10.權利要求9的方法，其中通過電轉方法將sgRNA與Cas9編碼核苷酸共同導入所述造血干細胞。

11.權利要求10的方法，其中所述電轉條件為200-600V，0.5ms-2ms。

12.通過權利要求1～11中任一項所述的方法得到的造血干細胞。

13.一種通過基因改造使胎兒血紅蛋白(HbF)表達升高的人造血干細胞，其中該造血干細胞中第2號染色體第60495219位至第60495336位的BCL11A基因組區域通過基因編輯技術被破壞，其中，所述基因編輯技術為CRISPR/Cas9基因編輯技術，所述BCL11A基因組靶核苷酸序列與SEQ ID NO:4序列互補。

14.通過分化培養權利要求12或13所述的造血干細胞獲得的、處于成熟紅細胞之前的不同分化階段的前體細胞。

15.通過分化培養權利要求12或13所述的造血干細胞獲得的成熟紅細胞。

16.一種體外制造通過基因改造使胎兒血紅蛋白(HbF)表達升高的成熟紅細胞或其前體細胞的方法，該方法包括：

(a)使用權利要求1～11中任一項所述的方法得到基因改造的造血干細胞；

(b)使用造血干細胞紅系擴增和分化培養基對所述基因改造的造血干細胞進行造血干細胞紅系擴增和分化，

其中，所述造血干細胞紅系擴增和分化培養基包括基礎培養基，以及生長因子的組合物，其中所述生長因子的組合物包括干細胞生長因子(SCF)；白介素3(IL-3)和促紅細胞生成素(EPO)。

17.根據權利要求16所述的方法，該方法還包括：

使用紅系分化脫核培養基進行造血干細胞紅系分化脫核，

所述紅系分化脫核培養基包含基礎培養基、生長因子、以及孕酮受體和糖皮質激素受體的拮抗劑和/或抑制劑。