[發明專利]標記組合物及羥甲基化核酸文庫的構建方法

在審

• 申請號: 201811256087.3
• 申請日: 2018-10-26
• 公開（公告）號: CN109321647A
• 公開（公告）日: 2019-02-12
• 發明（設計）人: 馬曉花;苗志剛
• 申請（專利權）人: 蘇州森苗生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6876
• 分類號: C12Q1/6876;C12Q1/6869;C40B50/06
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 常亮

本發明涉及生物技術領域，特別涉及標記組合物及羥甲基化核酸文庫的構建方法。本發明利用UDP?6?N3?Glu和βGT對基因組DNA進行雙重標記；此外本發明還利用生物素進行特異性標記，使得帶有5hmC修飾的DNA片段能夠盡可能的全被捕獲下來；捕獲的DNA利用NEB相關試劑進行文庫建設，能夠保證文庫的質量較優，使測序結果變的穩定可靠。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及標記組合物及羥甲基化核酸文庫的構建方法。

背景技術

5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)是早在1952年發現的存在于噬菌體中胞嘧啶的一種修飾形式，也是最近同時在小鼠的神經元和胚胎干細胞中檢測到的存在于哺乳動物基因組中的又一種修飾方式。隨后，大量的研究集中于揭示5hmC和TET蛋白家族氧化酶在基因組組織以及鼠干細胞分化中可能承擔的角色，并且證明TET蛋白酶家族可以通過氧化作用將5mC轉換為5hmC。而Tet家族酶與疾病的發展與調控有關。已報道TET蛋白和5hmC存在于許多不同的組織中，并且它們的表達/活性在胚胎干細胞分化過程中受到嚴格調控。TET1和TET2均與癌癥有關：TET1在急性骨髓樣白血病(AML)和急性淋巴樣白血病(ALL)中是MLL的的一個配體，而TET2功能的缺失也與急性骨髓樣白血病(AML)以及各種骨髓細胞生成障礙綜合征和骨髓增生性疾病密切相關。TET蛋白和hmC引起DNA甲基化失調，在胚胎干細胞多潛能性，致癌性轉化以及神經元的功能中可能具有重要作用。

5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)是被稱之為第6種堿基的一種新的表觀遺傳學修飾，它是由Tet(Ten-Eleven-Translocation)家族在鐵離子與α-酮戊二酸存在的條件下氧化5-甲基胞嘧啶(5mC)而來。目前研究檢測發現，在受精卵、胚胎干細胞以及腦組織中，5hmC的含量都相當豐富，而腦組織以及胚胎干細胞中幾乎是其他組織的十倍，因此為進一步研究其生物學功能提供了線索。

目前用來檢測5hmC的主要方法是亞硫酸氫鈉法和β糖基轉移酶(β-glucosyltransferase，βGT)法。研究人員報道在在經過亞硫酸氫鈉處理之后，5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)會轉變為5-亞甲基磺酸鹽形式的胞嘧啶(cytosine5-methylenesulfonate，CMS)，這種磺酸鹽形式的胞嘧啶的脫氨基速率比甲基胞嘧啶更慢。在經過PCR信號擴增之后，5-羥甲基胞嘧啶位置的測序結果也會顯示為胞嘧啶。因此，傳統的亞硫酸氫鈉法測序并不能完整地反映基因組中各種堿基的真實分布情況，人們迫切需要尋找新的方法來解決5-羥甲基胞嘧啶檢測的問題。

現有技術通過βGT處理基因組DNA，利用MSPI酶進行切割，連接接頭，BST酶處理修復，EcoP15I酶切，片段選擇，連接P7接頭，PCR擴增建立文庫。但是上述實驗步驟繁瑣，需要多種酶進行切割連接；且容易丟失5hmC修飾的DNA片段，造成測序結果不準確。

因此，提供一種5-羥甲基胞嘧啶的檢測方法具有重要的現實意義。

發明內容

有鑒于此，本發明提供一種標記組合物及羥甲基化核酸文庫的構建方法。利用UDP-6-N3-Glu和βGT對基因組DNA進行雙重標記；此外還利用生物素進行特異性標記使得帶有5hmC修飾的DNA片段能夠盡可能的全被捕獲下來；捕獲的DNA我們利用NEB相關試劑進行文庫建設，能夠保證文庫的質量較優，使測序結果變的穩定可靠。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種標記組合物，包括UDP-6-N3-Glu和βGT。

在本發明的一些具體實施方案中，所述標記組合物還包括生物素。

在此基礎上，本發明還提供了所述標記組合物在檢測核酸羥甲基化修飾中的應用。

本發明還提供了所述標記組合物在制備核酸羥甲基化修飾的檢測制劑和/或檢測試劑盒中的應用。