[發(fā)明專利]一種依結(jié)構(gòu)層次系統(tǒng)凍存人臍帶組織的方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811255943.3
• 申請(qǐng)日: 2018-10-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109392891B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-10-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 崔光晶;徐峰波;王圣川;宋現(xiàn)收;王肇光;生德偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 銀豐生物工程集團(tuán)有限公司
• 主分類號(hào): A01N1/02
• 分類號(hào): A01N1/02;C12N5/0775
• 代理公司: 山東舜天律師事務(wù)所 37226
• 代理人: 李新海

1.一種依結(jié)構(gòu)層次系統(tǒng)凍存人臍帶組織的方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)臍帶羊膜組織的分離及凍存：用生理鹽水洗滌臍帶，剪去臍帶兩頭，再用生理鹽水涮洗，撕取或剪下表面羊膜組織；用生理鹽水沖洗羊膜組織，將羊膜折疊或平放于凍存袋中，加入預(yù)冷至4℃～10℃的平衡液，平衡5～10min，低溫離心去除平衡液，然后加入預(yù)冷至4℃～10℃的玻璃化凍存液Ⅰ，轉(zhuǎn)移至液氮冷凍保存；

所述平衡液，是通過(guò)以下方法得到：向基礎(chǔ)液中添加15～25wt％的乙二醇，即得；

所述玻璃化凍存液Ⅰ，是通過(guò)以下方法得到：向基礎(chǔ)液中添加40～60wt％的甘油、10～20wt％的海藻糖、8～15wt％的1,2-丙二醇，混勻，即得；

所述基礎(chǔ)液，為含20wt％人血白蛋白的α-MEM培養(yǎng)基；

(2)臍帶血管組織的分離及凍存：將上述已經(jīng)剝離羊膜的臍帶的動(dòng)脈血管和靜脈血管分離下，用生理鹽水清洗，并沖洗血管以去除血管內(nèi)滯留血塊，然后將血管剪成長(zhǎng)2～4cm的小段；將血管小段轉(zhuǎn)移至離存管中，加入預(yù)冷至4℃～10℃的平衡液，平衡5～10min，低溫離心去除平衡液，再轉(zhuǎn)移至凍存管中，加入預(yù)冷至4℃～10℃玻璃化凍存液Ⅱ，每1條血管小段加入1ml的玻璃化凍存液Ⅱ，分五步導(dǎo)入玻璃化凍存液，導(dǎo)入量依次為：50μl、150μl、150μl、200μl、450μl，每步之間平衡90s；導(dǎo)入完成后快速封口，轉(zhuǎn)移至液氮冷凍保存；

所述玻璃化凍存液Ⅱ：是通過(guò)以下方法得到：向基礎(chǔ)液中添加10wt％的二甲基亞砜、15wt％的海藻糖、10wt％的1,2-丙二醇，混勻，即得；

(3)臍帶華通氏膠組織的分離及凍存：用生理鹽水充分洗滌上述剝離羊膜和血管的臍帶，轉(zhuǎn)移至離心管中，剪碎成1～2cm³的組織塊；加入預(yù)冷至4℃～10℃的平衡液，平衡5～10min，低溫離心，去除上清，再將組織塊轉(zhuǎn)移至凍存管中，加入預(yù)冷至4℃～10℃的玻璃化凍存液Ⅲ，轉(zhuǎn)入程控降溫儀，按照設(shè)定的降溫程序降溫至-90℃，轉(zhuǎn)移至液氮冷凍保存；

所述玻璃化凍存液Ⅲ：是通過(guò)以下方法得到：向基礎(chǔ)液中添加10wt％的二甲基亞砜、8wt％的海藻糖、10wt％的1,2-丙二醇，5wt％的聚乙二醇，混勻，即得；

所述步驟(3)中的降溫程序?yàn)椋涸?℃保持8min；以1℃/min速率繼續(xù)降至-10℃，保持5min；以1.5℃/min速率繼續(xù)降至-40℃保持6min；以3℃/min速率繼續(xù)降至-80℃保持10min。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的依結(jié)構(gòu)層次系統(tǒng)凍存人臍帶組織的方法，其特征在于：所述低溫離心的具體參數(shù)為：4℃，1300rpm離心5min。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的依結(jié)構(gòu)層次系統(tǒng)凍存人臍帶組織的方法，其特征在于：所述步驟(1)中，所述取下的羊膜組織，每塊不小于10cm²。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的依結(jié)構(gòu)層次系統(tǒng)凍存人臍帶組織的方法，其特征在于：所述平衡液，是通過(guò)以下方法得到：向基礎(chǔ)液中添加20wt％的乙二醇，即得。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的依結(jié)構(gòu)層次系統(tǒng)凍存人臍帶組織的方法，其特征在于：

所述玻璃化凍存液Ⅰ，是通過(guò)以下方法得到：向基礎(chǔ)液中添加55wt％的甘油、15wt％的海藻糖、10wt％的1,2-丙二醇，混勻，即得；

和/或：所述玻璃化凍存液Ⅱ：是通過(guò)以下方法得到：向基礎(chǔ)液中添加10wt％的二甲基亞砜、15wt％的海藻糖、10wt％的1,2-丙二醇，混勻，即得；

和/或：所述玻璃化凍存液Ⅲ：是通過(guò)以下方法得到：向基礎(chǔ)液中添加10wt％的二甲基亞砜、8wt％的海藻糖、10wt％的1,2-丙二醇，5wt％的聚乙二醇，混勻，即得。