[發明專利]一種豬圓環病毒3型的聚合酶螺旋擴增檢測試劑及檢測方法

在審

• 申請號: 201811247874.1
• 申請日: 2018-10-25
• 公開（公告）號: CN109576395A
• 公開（公告）日: 2019-04-05
• 發明（設計）人: 冀君;許鑫;陳欽璽;王雪雨;闞云超;姚倫廣
• 申請（專利權）人: 南陽師范學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京中恒高博知識產權代理有限公司 11249
• 代理人: 呂玉博

本發明屬于病毒檢測技術領域，具體涉及一種豬圓環病毒3型的聚合酶螺旋擴增檢測試劑及檢測方法(Polymerase spiral reaction，PSR)。為快速診斷和檢測豬圓環病毒3型，本發明根據其ORF2基因保守區設計合成特異性PSR引物，包括上游引物S1和下游引物S2，并通過Bst DNA聚合酶、Mg²⁺、dNTPs濃度及反應條件優化，建立了聚合酶螺旋擴增檢測方法。檢測試劑包括如下組分10×Bst Buffer反應緩沖液、dNTPs、MgSO₄、Bst DNA聚合酶、去離子水、顯色試劑和上述引物。本發明提供的檢測試劑在應用時具有靈敏特異、簡便快捷等優點，可用于PCV3的檢測和臨床診斷。

技術領域

本發明屬于病毒檢測技術領域，具體涉及一種豬圓環病毒3型的聚合酶螺旋擴增檢測試劑及檢測方法。

背景技術

豬圓環病毒(Porcine circovirus，PCV)是一種單鏈環狀DNA病毒，無囊膜，成熟的病毒粒子由60個核衣殼蛋白(capsid protein，Cap)亞基組裝成一個直徑為17～20nm的正二十面體的球形顆粒，編碼兩個主要的開放閱讀框(ORFs)：cap和rep(和病毒復制相關的酶)。Cap是PCV唯一的結構蛋白和主要抗原，由232～234個氨基酸殘基組成，相對分子質量約為27ku。PCV最早是由德國學者從豬腎上皮細胞(PK15)中分離得到的非致病性病毒粒子里PCV1，后來加拿大學者報道了斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(postweaning multisystemicwasting syndrome，PMWS)的出現，并證實PCV2為主要病原，隨后PCV2在全世界廣泛分布，給全球養殖業帶來了巨大的經濟損失。與PCV2相關的疾病包括斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)、豬皮炎腎病綜合征(porcinedermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)、呼吸系統疾病(respiratory disease)、繁殖障礙(reproductive failure)和腸道疾病(enteric disease)等。2016年10月，美國學者Palinski和Phan報道了一種新的PCV基因型，又稱PCV3，該病毒從出現病癥的母豬或仔豬中分離得到，同時PCV2檢測為陰性。

2017年，我國學者Deng等采用間接ELISA對我國豬群開展了PCV3的血清學調查，結果發現，2015-2017年間，我國豬群PCV3的感染率從22.35％上升到51.88％，表明PCV3已經在我國豬群流行和擴散，防控形勢非常嚴峻。據報道，PCV3可導致母豬厭食、皮炎腎病綜合征、繁殖障礙，如流產、產木乃伊胎、死胎、弱仔等癥狀，鑒于PCV3型和PCV2型所引起的臨床癥狀十分相似，在臨床上很難區分，且PCV3呈現多地域感染的現狀，因此建立快速、準確的PCV3相關診斷方法是防控和診斷PCV3的基礎。

有關PCV3的檢測技術的研究主要從免疫學技術和分子生物學兩個方面進行探討。其中Palinski等利用PCV3特異性單克隆抗體染色患病豬組織切片，建立了免疫組化方法，利用原核表達的PCV3Cap蛋白包被ELISA板，建立了檢測PCV3抗體的間接ELISA方法，針對Cap蛋白制備單克隆抗體，建立了免疫熒光檢測方法。分子生物學檢測技術主要包括PCR、熒光定量PCR、原位雜交等。

目前核酸擴增是基因診斷技術中最常用的方法之一，常用方法有聚合酶鏈式反應(PCR)、依賴核酸序列擴增(NASBA)、自主序列復制(SR)以及鏈置換技術(SDA)等，都能將微量標本進行快速擴增，但在特異性、簡便程度、溫度和試劑儀器要求等方面各有缺點。本發明所涉及的聚合酶螺旋擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,PSR)是2000年由日本Notomi等人開發出來的一種體外核酸擴增的新型技術，它能夠在90min內，水浴鍋環境等溫條件下，把拷貝數很低的DNA片段擴增到10⁹個拷貝。