[發明專利]一種鷹嘴豆乳內產GABA的乳酸菌菌株的篩選方法

在審

• 申請號: 201811247079.2
• 申請日: 2018-10-25
• 公開（公告）號: CN109280714A
• 公開（公告）日: 2019-01-29
• 發明（設計）人: 李文;王陶
• 申請（專利權）人: 徐州工程學院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/04
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標事務所(普通合伙) 32249
• 代理人: 楊曉玲

1.一種鷹嘴豆乳內產GABA的乳酸菌菌株的篩選方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)制備鷹嘴豆乳塊與水的混合液；

2)采用紙層析法分離混合液中的氨基酸；

3)使用高效液相色譜儀判斷混合液中產GABA的乳酸菌；

4)對混合液中產GABA的乳酸菌進行形態學鑒定；

5)對混合液中產GABA的乳酸菌進行生理生化試驗；

6)使用16SrDNA序列鑒定混合液中產GABA的乳酸菌的菌株；

7)對步驟2)至6)的檢測結果進行對比分析，篩選出混合液中產GABA的乳酸菌菌株。

2.根據權利要求1所述的一種鷹嘴豆乳內產GABA的乳酸菌菌株的篩選方法，其特征在于，步驟1)中，將鷹嘴豆乳塊與水混合，并攪拌均勻后，在25～40℃的環境中靜置10min。

3.根據權利要求1所述的一種鷹嘴豆乳內產GABA的乳酸菌菌株的篩選方法，其特征在于，步驟2)具體步驟包括：首先，在濾紙條上端邊緣約1厘米的中央剪一小孔，將濾紙條平放于潔凈的紙上，在距離濾紙下端25mm處用鉛筆輕畫一橫線，并在橫線的中央畫一直徑為2mm的小圓圈，用毛細管吸取步驟1)中混合液，在濾紙條下端的小圓圈內點樣，取干燥大試管，加入被水飽和的酚溶液，在距濾紙條下端12.5mm處穿大頭針，從濾紙條上端小孔處穿棉線并左右分開，調節線的高度使濾紙垂直懸于試管內且下湍浸入溶液12.5mm，此時即可看到溶劑向上移動，溶劑升到一定高度時，小心將紙條取出，以鉛筆標出溶劑上升的前沿，將濾紙條兩端，用大頭針釘在小木框上，吹干后用噴霧器均勻地噴一層0.2％茚三酮乙醇溶液，然后再將濾紙條吹干，即可看到紙上顯出各個色點，每個色點代表一種氨基酸。

4.根據權利要求1所述的一種鷹嘴豆乳內產GABA的乳酸菌菌株的篩選方法，其特征在于，步驟3)包括：

3.1)產GABA的乳酸菌的初次判斷：使用高效液相色譜儀將步驟1)制備的混合液抽入進樣閥，由流動相帶入色譜柱內，在柱內的各個氨基酸成分被分離后，依次進入檢測器進行檢測，高效液相色譜儀內部的記錄裝置經過對比分析將GABA的各項數據記錄下來；

3.2)產GABA的乳酸菌的二次判斷：取步驟1)中混合液靜置20-24h，再次使用高效液相色譜儀進行檢測，記錄下GABA的各項數據，通過對比數據觀察GABA的量增加。

5.根據權利要求1所述的一種鷹嘴豆乳內產GABA的乳酸菌菌株的篩選方法，其特征在于，步驟4)包括：取步驟1)中制備的混合液放入光學顯微鏡下，通過形態學鑒定，觀察培養特征、細胞形態及其染色特性、特殊的細胞結構、運動性，與常規GABA進行對比，鑒定混合液中存在產GABA的乳酸菌的菌株。

6.根據權利要求1所述的一種鷹嘴豆乳內產GABA的乳酸菌菌株的篩選方法，其特征在于，步驟5)包括：取步驟1)中制備的混合液進行糖、醇發酵試驗，通過不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，來鑒別GABA，再提取步驟1)中制備的混合液進行耐鹽試驗，最后提取步驟1)中制備的混合液進行不同溫度試驗，確定產GABA的乳酸菌的存在。

7.根據權利要求1所述的一種鷹嘴豆乳內產GABA的乳酸菌菌株的篩選方法，其特征在于，步驟6)包括：取步驟1)中制備的混合液，采用細菌總DNA提取試劑盒提取基因組DNA，采用細菌的16S rDNA通用引物進行PCR擴增，PCR結束后，吸取PCR產物5μL與1μL loadingbuffer混合，用1.0％的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結束后用溴化乙錠EB染色20～30min，PCR產物經純化后測序，將16S rDNA序列與GenBank數據庫中的核苷酸序列進行同源性分析，對產GABA的乳酸菌進行鑒定。

8.根據權利要求7所述的一種鷹嘴豆乳內產GABA的乳酸菌菌株的篩選方法，其特征在于，所述瓊脂糖凝膠電泳所需的電壓為100V。