[發(fā)明專利]一種基因敲除選育bai2基因缺失型斑馬魚的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811246122.3
• 申請日: 2018-10-25
• 公開（公告）號: CN109280666A
• 公開（公告）日: 2019-01-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄧云;歐陽詩;謝華平;劉樂;陳坤
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南師范大學(xué)
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/90;A01K67/027
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本發(fā)明涉及基因敲除技術(shù)領(lǐng)域，特別是公開了一種基因敲除選育bai2基因缺失型斑馬魚的方法，通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，在斑馬魚的bai2基因上設(shè)計合適的打靶位點，在體外合成的特異性gRNA，顯微共注射進(jìn)入斑馬魚一細(xì)胞內(nèi)，胚胎培養(yǎng)50h后，通過選取胚胎進(jìn)行基因型分析，從而證實了所選位點的有效性。本發(fā)明能更高效且更精確地在生物體基因組中沉默特定基因，且制作簡單、成本低，還可同時對靶基因上多個位點進(jìn)行剪切，沉默任意數(shù)目的單個基因。干擾bai2基因的表達(dá)，并且通過遺傳學(xué)手段研究其功能，有助于進(jìn)一步揭示心臟形態(tài)發(fā)生的整個過程以及調(diào)控這些過程的分子機制，在醫(yī)學(xué)上心臟疾病病理的理解和新的治療方案的研發(fā)中具有十分重要的意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因敲除領(lǐng)域，特別是公開了一種基因敲除選育bai2基因缺失型斑馬魚的方法。

背景技術(shù)

bai2（又稱adgrb2，adhesion G protein-coupled receptor B2）基因位于斑馬魚第19號染色體上，包含14個外顯子，cDNA全長1904bp，同時通過基因差異表達(dá)譜分析和基因組關(guān)聯(lián)分析等，發(fā)現(xiàn)bai2基因在人類胚胎早期的多個組織中都有表達(dá)，特別的是，該基因與斑馬魚左右不對稱發(fā)育密切相關(guān)。

斑馬魚與人類心臟發(fā)育過程中的基因、信號通路有高度同源性，且bai2基因進(jìn)化上較為保守，研究發(fā)現(xiàn)bai2在斑馬魚胚胎早期表達(dá)量較高。而且，與其他動物模型相比，斑馬魚具有個體小、易于飼養(yǎng)、發(fā)育快、繁殖能力強、體外受精、胚胎體外發(fā)育且透明等優(yōu)點。

基因打靶技術(shù)起源于20世紀(jì)80年代末，是一種通過對基因組進(jìn)行定點修飾來研究基因功能的重要方法手段，也可用于治療人類的各種遺傳性疾病。該技術(shù)主要是利用缺失突變、基因滅活、染色體大片段刪除以及外源基因?qū)氲确绞絹砀淖兩锏倪z傳信息，并且在生殖系中穩(wěn)定遺傳后表達(dá)突變性狀，從而研究生物體內(nèi)特定基因在生長發(fā)育過程中的作用，所以這類技術(shù)手段已成為現(xiàn)代分子生物學(xué)研究熱點。傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)是建立在胚胎干細(xì)胞(ESC) 和同源重組技術(shù)的基礎(chǔ)之上，故打靶技術(shù)效率極低。2013年初，一種全新的人工核酸內(nèi)切酶clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9，該技術(shù)具有操作簡單、成本低的特點，能更高效、更精確地在生物體基因組中沉默特定基因，且可同時對靶基因上多個位點進(jìn)行剪切，沉默任意數(shù)目的單個基因，但與此同時，該技術(shù)存在一定的缺陷，其脫靶率相對較高。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有基因打靶技術(shù)中存在的脫靶率相對較高問題，本發(fā)明提供了一種基因敲除選育bai2基因缺失型斑馬魚的方法，能更高效且更精確地在生物體基因組中沉默特定基因，且制作簡單、成本低，還可同時對靶基因上多個位點進(jìn)行剪切，沉默任意數(shù)目的單個基因，脫靶率較低。與此同時，通過研究bai2基因的缺失與其他器官的發(fā)育的相關(guān)性，這將為醫(yī)學(xué)研究提供更多信息

解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：

1）分別設(shè)計CRISPR/Cas9基因敲除靶位點和檢測引物

在National Center for Biotechnology Information（NCBI）上查詢斑馬魚bai2基因的基因組DNA序列，在網(wǎng)站SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）上分析其功能結(jié)構(gòu)域，根據(jù)CRISPR/Cas敲除原理，在網(wǎng)站The ZiFiT Targeter (http://zifit.partners.org/ZiFiT/) 上設(shè)計bai2基因的靶位點；

兩對特異性靶位點PCR 引物如下：

F1（靶位點a正向引物）：

TGTAATACGACTCACTATAggtacggctccttctcgctcGTTTTAGAGCTAGAAATAGC