[發(fā)明專利]制備帶有雙鏈分子標(biāo)簽的新一代測序接頭的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811245188.0
• 申請(qǐng)日: 2018-10-25
• 公開（公告）號(hào): CN109402242A
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭賢杰;朱垚;曹振;秦雪梅;周雪峰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 翌圣生物科技(上海)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6869
• 分類號(hào): C12Q1/6869
• 代理公司: 上海精晟知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

1.一種制備帶有雙鏈分子標(biāo)簽的新一代測序接頭的方法，其特征在于，包括：

步驟一：合成接頭序列，接頭序列包含第一序列和第二序列，其中，所述第二序列包括：限制性內(nèi)切酶的保護(hù)堿基和7個(gè)隨機(jī)堿基的雙鏈分子標(biāo)簽，以及限制性內(nèi)切酶HphI的酶切位點(diǎn)，第一序列和第二序列中具有互補(bǔ)的序列片段，

步驟二：接頭序列退火，混勻第一序列和第二序列，在退火體系中按退火程序退火形成雙鏈，

步驟三：補(bǔ)齊步驟二中所形成的雙鏈的接頭，

步驟四：酶切并回收接頭。

2.如權(quán)利要求1所述的制備帶有雙鏈分子標(biāo)簽的新一代測序接頭的方法，其特征在于：

其中，所述第二序列中還具有隨機(jī)堿基的單鏈分子標(biāo)簽。

3.如權(quán)利要求1所述的制備帶有雙鏈分子標(biāo)簽的新一代測序接頭的方法，其特征在于：

其中，所述第二序列中還具有樣本標(biāo)簽。

4.如權(quán)利要求1所述的制備帶有雙鏈標(biāo)簽的新一代測序接頭的方法，其特征在于：

步驟三中，采用T4DNA聚合酶延伸補(bǔ)平步驟二中的退火產(chǎn)物。

5.如權(quán)利要求1所述的制備帶有雙鏈分子標(biāo)簽的新一代測序接頭的方法，其特征在于：

步驟四中，采用限制性內(nèi)切酶HphI酶切步驟三中的延伸產(chǎn)物，然后去除50bp以內(nèi)的殘余雙鏈小片段，保留接頭。

6.如權(quán)利要求1所述的制備帶有雙鏈分子標(biāo)簽的新一代測序接頭的方法，其特征在于：

第一序列的序列如下：

5-A*A*TGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC-GCTCTTCCGAT*C*T-3。

7.如權(quán)利要求1所述的制備帶有雙鏈分子標(biāo)簽的新一代測序接頭的方法，其特征在于：

第二序列的序列如下：

5-NNNN-ANNNNNNNTCACC-AG*A*TCGGAAGAGC-ACACGTCTGAACTCCAGTCAC-NNNN-NNNNNNNN-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCT*T*G-3

其中，第1至4位為限制性內(nèi)切酶的保護(hù)堿基，堿基數(shù)0-10個(gè)，

第6位至第12位是七個(gè)隨機(jī)堿基的雙鏈分子標(biāo)簽，

第52位至第55位是四個(gè)隨機(jī)堿基的單鏈分子標(biāo)簽，

第56位至第63位是6-8個(gè)堿基的樣本標(biāo)簽，

第5位至第17位是限制性內(nèi)切酶HphI的酶切位點(diǎn)。