[發明專利]一種制備帶有多個分子標簽的二代測序接頭的方法

在審

• 申請號: 201811245181.9
• 申請日: 2018-10-25
• 公開（公告）號: CN109371109A
• 公開（公告）日: 2019-02-22
• 發明（設計）人: 鄭賢杰;朱垚;曹振;袁慧艷;宋東亮
• 申請（專利權）人: 翌圣生物科技(上海)有限公司
• 主分類號: C12Q1/6811
• 分類號: C12Q1/6811
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

本發明提供一種制備帶有多個分子標簽的二代測序接頭的方法，其特征在于，包括：步驟一：合成接頭序列，接頭序列包含第一序列和第二序列，其中，所述第二序列包括：限制性內切酶的保護堿基和5個隨機堿基的雙鏈分子標簽，以及酶切位點中的可變堿基，第一序列和第二序列中具有互補的序列片段，步驟二：接頭序列退火，混勻第一序列和第二序列，在退火體系中按退火程序退火形成雙鏈，步驟三：補齊步驟二中所形成的雙鏈的接頭，步驟四：酶切并回收接頭。接頭中含有更長的雙鏈分子標簽，為生息分析提供更好的信息基礎；可以有效、較經濟實惠地合成獲得；適用于多種測序平臺。

技術領域

本發明涉及一種制備帶有多個分子標簽的二代測序接頭的方法，屬 于分子生物學領域。

背景技術

在Illumina測序平臺中，接頭是二代測序建庫中必要的元素，目前 官方的接頭包含多種類型，序列中包含了p5與p7擴增引物結合序列、 read1和read2測序引物結合序列、樣本標簽序列、分子標簽序列等，并 且帶有用于A/T連接的3’-dT尾。

目前常于p7端設計單鏈分子標簽用于給建庫中的目標分子添加標 簽，使生信分析過程可以捕獲到更精細的分子信息，降低變異分析的背 景噪音。

另外，也可以通過雙鏈分子標簽，結合單鏈分子標簽，通過生信將 變異分析的背景噪音降得更低，使測序分析結果更加精準可靠。

但是，目前沒有較好的雙鏈標簽添加方法方便于文庫構建。

發明內容

本發明的目的在于提供一種制備帶有多個分子標簽的二代測序接頭 的方法，以解決上述問題。

本發明采用了如下技術方案：

一種制備帶有多個分子標簽的二代測序接頭的方法，其特征在于， 包括：

步驟一：合成接頭序列，接頭序列包含第一序列和第二序列， 其中，所述第二序列包括：限制性內切酶的保護堿基和5個隨機堿基的 雙鏈分子標簽，以及酶切位點中的可變堿基，第一序列和第二序列中具 有互補的序列片段，

步驟二：接頭序列退火，混勻第一序列和第二序列，在退火體系中 按退火程序退火形成雙鏈，

步驟三：補齊步驟二中所形成的雙鏈的接頭，

步驟四：酶切并回收接頭。

進一步，本發明的制備帶有多個分子標簽的二代測序接頭的方法， 還可以具有這樣的特征：其中，所述第二序列中還具有隨機堿基的單鏈 分子標簽。

進一步，本發明的制備帶有多個分子標簽的二代測序接頭的方法， 還可以具有這樣的特征：其中，所述第二序列中還具有樣本標簽。

進一步，本發明的制備帶有多個分子標簽的二代測序接頭的方法， 還可以具有這樣的特征：其中，所述第二序列中還具有限制性內切酶 BciVI的酶切位點。

進一步，本發明的制備帶有多個分子標簽的二代測序接頭的方法， 還可以具有這樣的特征：步驟三中，采用T4DNA聚合酶延伸補平步驟 二中的退火產物。

進一步，本發明的制備帶有多個分子標簽的二代測序接頭的方法， 還可以具有這樣的特征：步驟四中，采用限制性內切酶BmrI酶切步驟三 中的延伸產物，然后去除50bp以內的殘余雙鏈小片段，保留接頭。

進一步，本發明的制備帶有多個分子標簽的二代測序接頭的方法， 還可以具有這樣的特征：第一序列的序列如下：

5-A*A*TGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC-GCTC TTCCGAT*C*T-3。

進一步，本發明的制備帶有多個分子標簽的二代測序接頭的方法， 還可以具有這樣的特征：第二序列的序列如下：