[發明專利]制備帶有分子標簽的新一代測序接頭的方法在審
| 申請號： | 201811245173.4 | 申請日： | 2018-10-25 |
| 公開（公告）號： | CN109321568A | 公開（公告）日： | 2019-02-12 |
| 發明（設計）人： | 鄭賢杰;朱垚;曹振;李劍輝;宋東亮 | 申請（專利權）人： | 翌圣生物科技(上海)有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/11 | 分類號： | C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/6806 |
| 代理公司： | 上海精晟知識產權代理有限公司 31253 | 代理人： | 馮子玲 |
| 地址： | 200120 上海市浦*** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 退火 分子標簽 接頭序列 新一代 測序 制備 限制性內切酶 雙鏈分子 雙鏈 標簽 測序平臺 酶切位點 隨機堿基 退火程序 信息基礎 序列片段 補齊 混勻 堿基 酶切 合成 回收 分析 | ||
1.一種制備帶有分子標簽的新一代測序接頭的方法，其特征在于，包括：
步驟一：合成接頭序列，接頭序列包含第一序列和第二序列，其中，所述第二序列包括：限制性內切酶的保護堿基和6個隨機堿基的雙鏈分子標簽，以及限制性內切酶MnlI的酶切位點，第一序列和第二序列中具有互補的序列片段，
步驟二：接頭序列退火，混勻第一序列和第二序列，在退火體系中按退火程序退火形成雙鏈，
步驟三：補齊步驟二中所形成的雙鏈的接頭，
步驟四：酶切并回收接頭。
2.如權利要求1所述的制備帶有分子標簽的新一代測序接頭的方法，其特征在于：
其中，所述第二序列中還具有隨機堿基的單鏈分子標簽。
3.如權利要求1所述的制備帶有分子標簽的新一代測序接頭的方法，其特征在于：
其中，所述第二序列中還具有樣本標簽。
4.如權利要求1所述的制備帶有分子標簽的新一代測序接頭的方法，其特征在于：
步驟三中，采用T4DNA聚合酶延伸補平步驟二中的退火產物。
5.如權利要求1所述的制備帶有分子標簽的新一代測序接頭的方法，其特征在于：
步驟四中，采用限制性內切酶MnlI酶切步驟三中的延伸產物，然后去除50bp以內的殘余雙鏈小片段，保留接頭。
6.如權利要求1所述的制備帶有分子標簽的新一代測序接頭的方法，其特征在于：
第一序列的序列如下：
5-A*A*TGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC-GCTCTTCCGAT*C*T-3。
7.如權利要求1所述的制備帶有分子標簽的新一代測序接頭的方法，其特征在于：
第二序列的序列如下：
5-NNNN-ANNNNNNGAGG-AG*A*TCGGAAGAGC-ACACGTCTGAACTCCAGTCAC-NNNN-NNNNNNNN-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCT*T*G-3
其中，第1至4位為限制性內切酶的保護堿基，堿基數0-10個，
第6位至第11位是六個隨機堿基的雙鏈分子標簽，
第50位至第53位是四個隨機堿基的單鏈分子標簽，
第54位至第61位是6-8個堿基的樣本標簽，
第5位至第15位是為限制性內切酶MnlI的酶切位點。
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