[發明專利]一種編碼β-葡萄糖苷酶基因及其表達載體和蛋白

有效

• 申請號: 201811239932.6
• 申請日: 2018-10-23
• 公開（公告）號: CN109234293B
• 公開（公告）日: 2020-08-04
• 發明（設計）人: 李洪波;吳賢文;董海麗;胡興
• 申請（專利權）人: 懷化學院
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/42;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/06;C12R1/19
• 代理公司: 北京中政聯科專利代理事務所(普通合伙) 11489
• 代理人: 秦佩

本發明涉及一種編碼β?葡萄糖苷酶基因，至少含有下列核苷酸序列之一的DNA片：1)序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列；2)與SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性、且編碼相同生物學功能蛋白質的核苷酸序列；或3)與SEQ ID NO.1所示核苷酸序列雜交且編碼相同生物學功能蛋白質的核苷酸序列。按照本發明所述的基因序列進一步構建重組載體在大腸桿菌可實現了β?葡萄糖苷酶的可溶性表達，并簡單的通過親和純化，即可得到純度高于95％且濃度較高的保持天然構象的活性蛋白。這有利于產業化生產β?葡萄糖苷酶。

技術領域

本發明屬于生物分子克隆技術領域，涉及一種編碼β-葡萄糖苷酶基因及其表達載體和蛋白。

背景技術

β-葡萄糖苷酶(β-D-Glucosidase，EC3.2.1.21)，又稱β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，別名龍膽二糖酶、纖維二糖酶(cellobias，CB或β-G)和苦杏仁苷酶。它屬于纖維素酶類，是纖維素分解酶系中的重要組成成分，能夠水解結合于末端非還原性的β-D-葡萄糖鍵，同時釋放出β-D-葡萄糖和相應的配基。β-葡萄糖苷酶還具有轉糖苷活力，目的即通過具有轉苷活力的葡萄糖苷酶合成功能性低聚葡聚糖、低聚麥芽寡糖、低聚纖維寡糖等可以作為益生元的功能性糖類。因此，該蛋白在食品、飼養和保健品行業等方面都具有重要應用價值。β-葡萄糖苷酶能夠水解纖維二糖產生兩分子的葡萄糖,是纖維素酶的限速酶,但其含量少、活力低,成為纖維素酶解的瓶頸。

目前，已發現的β-葡萄糖苷酶大部分來自可培養微生物。然而,自然界中,超過99％的微生物不能進行純培養,嚴重限制了微生物資源的開發和利用。而且產β-葡萄糖苷酶的微生物主要包括曲霉、木霉、酵母和細菌,但產量低,不易大規模生產。目前關于纖維素酶生產菌株的研究,絕大部分集中于纖維素酶系齊全且酶活力較高的木霉如綠色木霉和里氏木霉等菌株上,但木霉菌發酵產物中存在多種真菌毒素。為克服無法大量生產β-葡萄糖苷酶，利用外源基因表達系統制備該蛋白是必然選擇。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的之一在于提供一種能編碼β-葡萄糖苷酶基因，目的之二在于提供這種基因所編碼的β-葡萄糖苷酶，以及含有這種基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌等表達載體，目的之四在于提供一種所述基因所編碼的β-葡萄糖苷酶的制備方法。

為達到上述目的，本發明提供如下技術方案：

1.一種編碼β-葡萄糖苷酶基因，所述基因至少含有下列核苷酸序列之一的DNA片段：

1)序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列；

2)與SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性、且編碼相同生物學功能蛋白質的核苷酸序列；

3)與SEQ ID NO.1所示核苷酸序列雜交且編碼相同生物學功能蛋白質的核苷酸序列。

進一步，與SEQ ID NO.1所示核苷酸序列雜交條件為：50℃，在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中雜交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；

還可以雜交條件為50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中雜交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；

還可以雜交條件為50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中雜交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；

還可以雜交條件為50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中雜交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；