[發明專利]檢測乙肝病毒rcDNA和/或cccDNA的寡核苷酸組合物、試劑盒和方法及用途

有效

• 申請號: 201811239651.0
• 申請日: 2018-10-24
• 公開（公告）號: CN109321679B
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發明（設計）人: 魯鳳民;劉永振;鄒軍
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京北匯律師事務所 11711
• 代理人: 李英杰

本發明公開用于檢測乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)松弛環狀DNA(relaxed circular DNA,rcDNA)和/或共價閉合環狀DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的寡核苷酸組合物、試劑盒和方法及用途。其中寡核苷酸組合物包括第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，或者與第一寡核苷酸的序列互補的寡核苷酸和與第二寡核苷酸的序列互補的寡核苷酸；第一寡核苷酸特異性結合至第一序列的至少一部分連續序列，第二寡核苷酸特異性結合至第二序列的至少一部分連續序列，且兩個連續序列之間的距離為30?350nt，第一序列為含有cccDNA或rcDNA的跨缺口區的HBV直接重復(direct repeat,DR)序列的DR2?DR1之間的序列，第二序列為DR1的第五個堿基之后的序列。本發明可以有效檢測HBV rcDNA和/或cccDNA的水平，而不受整合HBV DNA的影響。

技術領域

本發明涉及乙型肝炎病毒的檢測，具體地涉及用于檢測乙型肝炎病毒rcDNA和/或cccDNA的寡核苷酸組合物、試劑盒和方法。

背景技術

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染呈世界性流行，不同地區HBV感染的流行強度差異很大。根據病毒基因組序列相似度，HBV至少分為10個基因型(A-J)。據世界衛生組織報道，全球約20億人曾感染HBV，其中2.4億人為慢性HBV感染者。我國屬于中高流行區，HBV感染以B型和C型為主。在2006年全國乙型肝炎血清流行病學調查中，我國1-59歲一般人群HBsAg攜帶率為7.18％。據此推算，我國慢性HBV感染者約為9300萬人，其中慢性乙型肝炎(慢乙肝)患者約2000萬例。HBV持續感染引起慢性乙型肝炎(CHB)，也是肝硬化和肝細胞癌(HCC)發生發展的重要因素。在我國，一半以上的肝硬化和HCC患者由HBV引起。

HBV屬嗜肝DNA病毒科，是已知最小的DNA病毒之一，基因組為全長約3.2kb(3182-3248，不同基因型病毒基因組序列長度有所不同)的不完全閉合環形DNA(rcDNA)，雙鏈長度不對稱，單鏈部分占全長的15-50％。HBV子代病毒復制存在以前基因組 RNA(pgRNA)為模板逆轉錄合成子代病毒DNA的過程，該過程發生在P蛋白與pgRNA 結合并招募核心抗原形成的核衣殼內。跳轉后的逆轉錄起始于pgRNA的3’末端的DR1 區并沿pgRNA向其5’端逐步延伸，同時模板pgRNA在P蛋白的RNase H作用下被分段降解。HBV負鏈合成完成后正鏈合成開始，正鏈DNA以新合成負鏈DNA為模板，其引物為5’端殘余的pgRNA，該引物跳轉至負鏈DR2區并向負鏈5’端延伸至末尾，然后再次發生跳轉，至負鏈3’末端繼續延伸合成正鏈。由于很快獲得包膜并釋放出細胞，子代病毒的正鏈不完整，長度為負鏈全長的15-50％。子代病毒所含的病毒核酸為不完全閉合環形的松弛型rcDNA，病毒感染后rcDNA進入細胞核經加工后形成cccDNA，HBV cccDNA是病毒各種轉錄本轉錄的模板，由于其以微小染色體形式存在于細胞核中，是 HBV持續存在難以清除以及發生再感染的遺傳學因素。HBV結構的示意圖見圖1。