[發(fā)明專利]一種天然α-syn寡聚體抗體的制備方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811238751.1
• 申請(qǐng)日: 2018-10-23
• 公開（公告）號(hào): CN109293770A
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉瑞田;黃亞茹;謝喜秀
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院過程工程研究所
• 主分類號(hào): C07K16/18
• 分類號(hào): C07K16/18;C07K1/22;A61K39/395;A61P25/16
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發(fā)明涉及一種天然α?syn寡聚體抗體的制備方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用，所述制備方法為利用聚丙烯酰胺凝膠和交聯(lián)的α?syn寡聚體制備α?syn寡聚體親和凝膠，將靜脈注射免疫球蛋白稀釋后上樣于α?syn寡聚體親和凝膠柱，然后用洗脫液將結(jié)合的抗體洗脫出來，得到天然α?syn寡聚體抗體。該法制備得到的天然α?syn寡聚體抗體靶向性明確、專一，使用劑量易控制，從而能充分發(fā)揮該類抗體的治療作用，在帕金森病等α?syn相關(guān)的疾病治療方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種抗體的制備方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用，尤其涉及一種天然α-syn寡聚體抗體的制備方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用。

背景技術(shù)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是發(fā)病率僅次于老年癡呆的一種神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為震顫、肌強(qiáng)直、動(dòng)作遲緩、姿勢(shì)平衡障礙等運(yùn)動(dòng)癥狀和嗅覺減退、便秘、睡眠行為異常和抑郁等非運(yùn)動(dòng)癥狀。我國65歲以上人群總體患病率為1700/10萬，并隨年齡增長而升高，給家庭和社會(huì)都帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。據(jù)估計(jì)目前世界上大約有1000萬PD患者，尚無任何特異性治療藥物面世。因此，對(duì)PD有效治療藥物的研究刻不容緩。

PD有兩個(gè)主要的病理特征：一是患者大腦黑質(zhì)部位多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞程序性死亡，在約70-80％多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞死亡后，就會(huì)出現(xiàn)臨床癥狀；二是患者腦內(nèi)有不溶性路易斯小體和Lewy神經(jīng)突出現(xiàn)，其主要成分為聚集的α突觸核蛋白(α-synuclein，α-syn)。α-syn單體含有140個(gè)氨基酸，主要存在于前突觸末端，可能與突觸的可塑性有關(guān)。α-syn單體可聚集形成寡聚體、前纖維和纖維。在各種形式的α-syn聚集體中，寡聚體可能是最具有毒性的，是PD發(fā)生發(fā)展的主要致病因素。動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)也證實(shí)α-syn基因的突變、錯(cuò)誤剪切或過表達(dá)導(dǎo)致的α-syn聚集與PD的發(fā)生直接相關(guān)。腦內(nèi)α-syn聚集體具有神經(jīng)毒性，能夠破壞神經(jīng)細(xì)胞膜，導(dǎo)致活性氧自由基的大量產(chǎn)生，引起氧化應(yīng)激，線粒體損傷，脂質(zhì)和蛋白過氧化，鈣平衡紊亂，炎癥因子釋放增加，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞功能紊亂，甚至凋亡。這些病理變化進(jìn)而使得病人和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的行為和認(rèn)知功能發(fā)生明顯衰退，加速PD的進(jìn)程。大量研究也確認(rèn)，PD的嚴(yán)重程度與病人和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物腦內(nèi)的α-syn聚集體水平密切相關(guān)。

α-syn產(chǎn)生與清除之間的平衡被打破是PD病理學(xué)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。基于α-syn的致病機(jī)理，對(duì)PD治療藥物的研究主要從三個(gè)方面入手：降低α-syn產(chǎn)生、抑制α-syn的聚集和加快α-syn的清除。基于α-syn的被動(dòng)或主動(dòng)免疫治療是目前PD研究的熱點(diǎn)。相對(duì)于主動(dòng)免疫，被動(dòng)免疫治療具有更強(qiáng)的可控性，同時(shí)被動(dòng)免疫不含T細(xì)胞表位，不會(huì)引起T細(xì)胞介導(dǎo)的腦膜炎，因而具有更好的安全性。針對(duì)α-syn的單克隆抗體有PRX002、BIIB-054、mAb4等，其中進(jìn)展最快的是PRX002和BIIB-054，這兩個(gè)抗體目前均已進(jìn)入臨床Ⅰ期試驗(yàn)。PRX002是一株人源化的針對(duì)聚集的α-syn的單克隆抗體，臨床Ⅰ期試驗(yàn)結(jié)果表明該抗體具有較好的安全性和耐受性，經(jīng)抗體治療后病人血清中α-syn的濃度降低高達(dá)94％。BIIB-054是從健康老人的記憶B細(xì)胞中分離出來的全人源的單克隆抗體，該抗體可特異性靶向致病性的α-syn，與α-syn單體不結(jié)合，臨床Ⅰ期試驗(yàn)結(jié)果表明該抗體也具有較好的安全性和耐受性。以上兩種抗體均進(jìn)入臨床Π期，表明利用抗體治療PD是可行的。

靜脈注射免疫球蛋白(Intravenous Immunoglobulin,IVIG)是從大量健康人群供體血漿中制備的免疫球蛋白混合物。自從1981年Imbach等偶然發(fā)現(xiàn)IVIG具有免疫調(diào)節(jié)作用以來，IVIG已被FDA批準(zhǔn)用于免疫缺陷、自身免疫疾病及吉蘭-巴雷綜合癥等神經(jīng)紊亂疾病的治療。Daniela等研究發(fā)現(xiàn)PD患者血液循環(huán)中的α-syn抗體水平明顯降低，推測α-syn抗體水平可能與PD的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。除了α-syn抗體水平，健康人中多種多樣的天然抗α-syn抗體對(duì)防止PD的發(fā)生發(fā)展也十分重要。同時(shí)，該類天然抗體的種類及其之間的比例也是人工制備的α-syn相關(guān)抗體無法比擬的。但是IVIG中只含有微量抗α-syn寡聚體抗體，以IVIG治療PD時(shí)，絕大多數(shù)的IVIG抗體都是無益的，其用量太高時(shí)，易導(dǎo)致副作用的發(fā)生，因而限制了IVIG對(duì)PD的治療用量。