[發(fā)明專利]適用于曼氏無(wú)針烏賊縫隙連接的基因標(biāo)記方法在審
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201811236675.0 | 申請(qǐng)日： | 2018-10-23 |
| 公開(kāi)（公告）號(hào)： | CN109439731A | 公開(kāi)（公告）日： | 2019-03-08 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 柳意樊 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 浙江海洋大學(xué) |
| 主分類號(hào)： | C12Q1/6841 | 分類號(hào)： | C12Q1/6841 |
| 代理公司： | 杭州浙科專利事務(wù)所(普通合伙) 33213 | 代理人： | 吳秉中 |
| 地址： | 316000 浙江省舟山市普陀海*** | 國(guó)省代碼： | 浙江;33 |
| 權(quán)利要求書(shū)： | 查看更多 | 說(shuō)明書(shū)： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 縫隙連接 曼氏無(wú)針烏賊 基因標(biāo)記 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 標(biāo)記蛋白 原位雜交 基因 原位雜交檢測(cè) 表達(dá)變化 基因變化 雜交信號(hào) 準(zhǔn)確位置 靶核酸 檢測(cè) 染色體 探針 收縮 | ||
1.適用于曼氏無(wú)針烏賊縫隙連接的基因標(biāo)記方法，其特征在于：包括，
采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)所述曼氏無(wú)針烏賊縫隙連接的基因表達(dá)變化；
采用原位雜交檢測(cè)所述曼氏無(wú)針烏賊縫隙連接的基因的表達(dá)分布；
所述基因?yàn)榭p隙連接的標(biāo)記蛋白Innexin。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適用于曼氏無(wú)針烏賊縫隙連接的基因標(biāo)記方法，其特征在于：所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)包括如下步驟：
1)提取曼氏無(wú)針烏賊基因組總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；
2)利用引物對(duì)cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)；
所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物為：5’-TATGCGAGACGTGGTCCCTA-3’；5’-ACCTGAAGCGCCACTAAACA-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的適用于曼氏無(wú)針烏賊縫隙連接的基因標(biāo)記方法，其特征在于：所述PCR擴(kuò)增片段大小為148bp；所述擴(kuò)增序列如SEQ ID NO:3所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的適用于曼氏無(wú)針烏賊縫隙連接的基因標(biāo)記方法，其特征在于：所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增采用SYBR Green染料法。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的適用于曼氏無(wú)針烏賊縫隙連接的基因標(biāo)記方法，其特征在于：所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μL：7.6μL ddH2O、0.4μL 20μM ForwardPrimer、0.4μL 20μM Reverse Primer、10μL 2×SYBR Premix Ex Taq、1.6μL cDNA模板。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的適用于曼氏無(wú)針烏賊縫隙連接的基因標(biāo)記方法，其特征在于：所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序選擇兩步法：
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適用于曼氏無(wú)針烏賊縫隙連接的基因標(biāo)記方法，其特征在于：所述原位雜交包括：組織切片復(fù)水、固定、消化、預(yù)雜交和雜交、雜交后洗滌、封閉、抗體、洗滌、孵育、洗滌、封閉、抗體、洗滌、染細(xì)胞核、顯色、封片后觀察拍照，所述固定步驟為：將復(fù)水后的組織切片浸入含有0.01％蘇氨酸的4％PFA-PBS溶液中，室溫固定15min，然后用1×PBST溶液洗滌3次，每次5min；所述蘇氨酸中L-蘇氨酸和D-蘇氨酸的比例為100:2.8-4.2。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的適用于曼氏無(wú)針烏賊縫隙連接的基因標(biāo)記方法，其特征在于：所述消化步驟為：將固定后的組織切片置于含10μg/ml蛋白酶K和0.8μg/ml水楊酸的溶液中，消化10min。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的適用于曼氏無(wú)針烏賊縫隙連接的基因標(biāo)記方法，其特征在于：所述原位雜交用正義和反義探針的序列為：5’-GTCCGGCCGAATTCACATCA-3’；5’-CAGGTTGATGGGCAGGACAC-3’。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的適用于曼氏無(wú)針烏賊縫隙連接的基因標(biāo)記方法，其特征在于：所述原位雜交擴(kuò)增片段大小為683bp，所述擴(kuò)增序列SEQ ID NO:6所示。
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